Molekulární maják - Molecular beacon

Struktura molekulárních majáků v jejich přirozených konformacích (nahoře) nebo hybridizovaných s řetězcem DNA (dole)

Molekulární majákynebo sondy molekulárního majáku, jsou oligonukleotid hybridizační sondy které mohou hlásit přítomnost konkrétních nukleové kyseliny v homogenních řešeních. Molekulární majáky jsou sponka do vlasů - molekuly ve tvaru s vnitřně uhasit fluorofor jehož fluorescence se obnoví, když se váží na cílovou sekvenci nukleové kyseliny. Toto je novýradioaktivní způsob detekce specifických sekvencí nukleových kyselin. Jsou užitečné v situacích, kdy buď není možné, nebo žádoucí izolovat hybridy cílové sondy od přebytku hybridizačních sond.

Molekulární majákové sondy

Struktura typické sondy molekulárního majáku

Typická sonda s molekulárním majákem je 25 nukleotidy dlouho.[Citace je zapotřebí ] Prostřední 15 nukleotidů je komplementárních k cíli DNA nebo RNA a nenakládají se navzájem, zatímco pět nukleotidů na každém konci je komplementárních k sobě navzájem spíše než k cílové DNA. Typickou strukturu molekulárního majáku lze rozdělit na 4 části: 1) smyčka, oblast 18–30 párů bází molekulárního majáku, která je komplementární k cílové sekvenci; 2) dřík vytvořený připojením k dvěma koncům smyčky dvou krátkých (5 až 7 nukleotidových zbytků) oligonukleotidů, které jsou navzájem komplementární; 3) 5 'fluorofor na 5' konci molekulárního majáku je kovalentně připojeno fluorescenční barvivo; 4) 3 'zhášecí (nefluorescenční) barvivo, které je kovalentně připojeno k 3' konci molekulárního majáku. Když je maják ve tvaru uzavřené smyčky, zhášeč se nachází v blízkosti fluoroforu, což má za následek zhášení jeho fluorescenční emise.

Pokud je detekovaná nukleová kyselina komplementární k řetězci ve smyčce, událost hybridizace dojde. Duplex vytvořený mezi nukleovou kyselinou a smyčkou je stabilnější než duplex, protože dřívější duplex zahrnuje více párů bází. To způsobí oddělení stonku a tím i fluoroforu a zhášeče. Jakmile fluorofor již není vedle zhášeče, osvětlení hybridu světlem vede k fluorescenční emisi. Přítomnost emisí hlásí, že došlo k události hybridizace, a proto je v testovaném vzorku přítomna cílová sekvence nukleové kyseliny.

Syntéza

Hlavní článek: Syntéza oligonukleotidů

Molekulární majáky jsou syntetický oligonukleotidy jehož příprava je dobře zdokumentována. Kromě konvenční sady nukleosidové fosforamidity, syntéza také vyžaduje pevný nosič derivatizovaný zhášedlem a fosforamiditovým stavebním blokem určeným pro připojení chráněného fluorescenčního barviva.

První použití termínu molekulární majáky, syntéza a demonstrace funkce bylo v roce 1996.[1]

Alternativní homogenní technologie stanovení

  • Stanovení 5'-nukleázy TaqMan[2]
  • Excitonem řízené sondy fluorescenčních oligonukleotidů (ECHO) citlivé na hybridizaci.[3]
  • Sondy s duální hybridizací (LightCycler®)
  • Sondy Scorpions®
  • Sondy LUX (Light Upon Extension)
  • Testy DNA vázající barviva (např. SYBR Green, SYTO9, Melt Doctor, LCGreen Plus atd.)

Aplikace

  • Detekce SNP[2]
  • Detekce nukleových kyselin v reálném čase
  • Kvantifikace PCR v reálném čase
  • Alelická diskriminace a identifikace[2]
  • Multiplexní PCR testy
  • Diagnostické klinické testy

Reference

  1. ^ Tyagi S; Kramer FR (1996). "Molekulární majáky: sondy, které fluoreskují po hybridizaci". Nat. Biotechnol. 14 (3): 303–8. doi:10.1038 / nbt0396-303. PMID  9630890. S2CID  27010207.
  2. ^ A b C Täpp I; Malmberg L; Rennel E; Wik M; et al. (Duben 2000). „Homogenní hodnocení jednonukleotidových polymorfismů: srovnání 5'-nukleázového testu TaqMan a sond Molecular Beacon“. Biotechniky. 28 (4): 732–8. doi:10.2144 / 00284rr02. PMID  10769752.
  3. ^ Akimitsu Okamoto (2011). „Sondy ECHO: koncept kontroly fluorescence pro praktické snímání nukleových kyselin“. Chem. Soc. Rev. 40 (12): 5815–5828. doi:10.1039 / c1cs15025a. PMID  21660343.