N-vázaná glykosylace - N-linked glycosylation

Různé typy s lipidem spojený oligosacharid (LLO) prekurzor produkovaný v různých organismech.

Nvázaná glykosylace, je připevnění oligosacharid, sacharid skládající se z několika molekul cukru, někdy označovaných také jako glykan k atomu dusíku ( amide dusík an asparagin (Asn) zbytek a protein ), v procesu zvaném N-glykosylace, studoval v biochemie.[1] Tento typ propojení je důležitý pro obě struktury[2] a funkce[3] některých eukaryotických proteinů. The N- propojené glykosylace proces probíhá v eukaryoty a široce v archaea, ale velmi zřídka v bakterie. Povaha Nnavázané glykany připojené k glykoproteinu jsou určeny proteinem a buňkou, ve které jsou exprimovány.[4] Také se liší napříč druh. Různé druhy syntetizují různé typy Nvázaný glykan.

Energetika tvorby vazeb

V glykoproteinu jsou zahrnuty dva typy vazeb: vazby mezi sacharidy zbytky v glykanu a vazba mezi glykanovým řetězcem a molekulou proteinu.

Cukr skupiny jsou navzájem spojeny v glykanovém řetězci prostřednictvím glykosidové vazby. Tyto vazby se obvykle tvoří mezi uhlíky 1 a 4 molekul cukru. Tvorba glykosidové vazby je energeticky nepříznivá, proto je reakce spojena s hydrolýza ze dvou ATP molekuly.[4]

Na druhou stranu připojení glykanového zbytku k proteinu vyžaduje rozpoznání a konsensuální sekvence. Nvázané glykany jsou téměř vždy připojeny k dusík atom asparaginového (Asn) postranního řetězce, který je přítomen jako součást Asn – X–Ser /Thr konsensuální sekvence, kde X je jakákoli aminokyselina kromě prolin (Pro).[4]

V živočišných buňkách je glykan navázaný na asparagin téměř nevyhnutelně N-acetylglukosamin (GlcNAc) v β-konfiguraci.[4] Tato p-vazba je podobná glykosidové vazbě mezi cukrovými skupinami ve struktuře glykanu, jak je popsáno výše. Místo toho, aby byl připoután k cukru hydroxyl skupina, anomerní uhlík atom je připojen k amidovému dusíku. Energie potřebná pro toto propojení pochází z hydrolýza a pyrofosfát molekula.[4]

Biosyntéza

Biosyntetická dráha Nvázané glykoproteiny: Syntéza Nvázaný glykan začíná v endoplazmatickém retikulu, pokračuje v Golgi a končí na plazmatické membráně, kde Nnavázané glykoproteiny jsou buď vylučovány, nebo jsou zabudovány do plazmatické membrány.

Biosyntéza N- vázané glykany probíhají ve 3 hlavních krocích:[4]

  1. Syntéza dolicholem vázaného prekurzorového oligosacharidu
  2. En bloc přenos prekurzorového oligosacharidu na protein
  3. Zpracování oligosacharidu

Syntéza, přenos en bloc a počáteční oříznutí prekurzoru oligosacharid se vyskytuje v endoplazmatické retikulum (ER). Následné zpracování a modifikace oligosacharidového řetězce se provádí v Golgiho aparát.

Syntéza glykoproteinů je tak prostorově oddělena v různých buněčných kompartmentech. Proto typ Nsyntetizovaný glykan, závisí na jeho dostupnosti pro různé enzymy přítomné v těchto buněčných kompartmentech.

I přes rozmanitost však vše N-glykany jsou syntetizovány společnou cestou se společnou základní glykanovou strukturou.[4]Struktura jádra glykanu je v podstatě tvořena dvěma N-acetylglukosamin a tři manóza zbytky. Tento jádrový glykan je poté dále zpracován a upraven, což má za následek pestrou škálu N-glykanové struktury.[4]

Syntéza prekurzorového oligosacharidu

Proces Nnavázaná glykosylace začíná tvorbou dolichol vázaný cukr GlcNAc. Dolichol je a lipid molekula složená z opakování isopren Jednotky. Tato molekula se nalézá připojená k membráně ER. Molekuly cukru jsou připojeny k dolicholu prostřednictvím pyrofosfátové vazby[4] (jeden fosfát byl původně spojen s dolicholem a druhý fosfát pocházel z nukleotid cukr). Oligosacharidový řetězec se poté prodlužuje přidáváním různých molekul cukru postupným způsobem za vzniku prekurzorového oligosacharidu.

Sestavení tohoto prekurzorového oligosacharidu probíhá ve dvou fázích: fáze I a II.[4] Fáze I se odehrává na cytoplazmatický strana ER a fáze II se odehrává na luminální straně ER.

Prekurzorová molekula připravená k přenosu na protein se skládá ze 2 GlcNAc, 9 manózy a 3 glukóza molekuly.

Postupná syntéza prekurzorového oligosacharidu v lumenu ER v průběhu N-vázaná glykosylace: diagram ilustruje kroky probíhající jak ve fázi I, tak ve fázi II, jak je popsáno v tabulce.
Fáze I
Kroky
Umístění
  • Dva UDP-GlcNAc zbytky jsou připojeny k molekule dolicholu zalité v ER membráně. Cukr a dolichol tvoří pyrofosfátovou vazbu.
  • Pět GDP-Man zbytky jsou připojeny k GlcNAc disacharid Tyto kroky provádí glykosyltransferázy.
  • Výrobek: Dolichol - GlcNAc2 - Muž5
Cytoplazmatická strana ER
V tomto bodě je glykan vázaný na lipidy přemístěn přes membránu, čímž je přístupný pro enzymy v lumenu endoplazmatického retikula. Tento translokační proces je stále špatně pochopen, ale předpokládá se, že je prováděn enzymem známým jako flippase.
Fáze II
  • Rostoucí glykan je vystaven na luminální straně membrány ER a jsou přidány následující cukry (4 manóza a 3 glukóza). Dol-P-Man

je dárcem rezidua manózy (formace: Dol-P + GDP-Man → Dol-P-Man + GDP) a Dol-P-Gluc je dárcem rezidua glukózy (formace: Dol-P + UDP-Glc → Dol-P- Glc + UDP).

  • Tyto další cukry jsou transportovány do lumenu z cytoplazmy ER připojením k molekule dolicholu a následnou translokací do lumenu pomocí flippázového enzymu. (K translokaci více cukrů najednou se používají různé dolicholy v membráně).
  • Výrobek: Dolichol - GlcNAc2 - Muž9-Glc3
Luminální strana ER

Přenos glykanu na protein

Jakmile se vytvoří prekurzorový oligosacharid, dokončený glykan se poté přenese do rodícího se organismu polypeptid v lumen membrány ER. Tato reakce je řízena energií uvolněnou ze štěpení pyrofosfátové vazby mezi molekulou dolichol-glykanu. Před přenosem glykanu na rodící se polypeptid je třeba splnit tři podmínky:[4]

  • Asparagin musí být umístěn v konkrétní shodné sekvenci v primární struktura (Asn – X – Ser nebo Asn – X – Thr nebo ve vzácných případech Asn – X – Cys).[5]
  • Asparagin musí být vhodně umístěn v trojrozměrné struktuře proteinu (cukry jsou polární molekuly a proto musí být navázán na asparagin nacházející se na povrchu proteinu a nesmí být pohřben v proteinu)
  • Asparagin musí být nalezen v luminální straně endoplazmatického retikula pro N-spojená glykosylace. Cílové zbytky se nacházejí buď v sekrečních proteinech, nebo v oblastech transmembránový protein který stojí před lumen.

Oligosacharyltransferáza je enzym odpovědný za rozpoznání konsensuální sekvence a přenos prekurzorového glykanu na akceptor polypeptidu, který je translatován v lumenu endoplazmatického retikula. N-vázaná glykosylace je tedy společná translační událost

Zpracování glykanu

Zpracování glykanu v ER a Golgi.

N- zpracování glykanů se provádí v endoplazmatickém retikulu a Golgiho těle. K počátečnímu ořezávání molekuly prekurzoru dochází v ER a následné zpracování probíhá v Golgi.

Po přenosu dokončeného glykanu na rodící se polypeptid jsou ze struktury odstraněny dva zbytky glukózy. Enzymy známé jako glykosidázy odstraňují některé zbytky cukru. Tyto enzymy mohou pomocí molekuly vody rozbít glykosidické vazby. Tyto enzymy jsou exoglykosidázy, protože pouze fungují monosacharid zbytky umístěné na neredukujícím konci glykanu.[4] Tento počáteční krok ořezávání se považuje za krok kontroly kvality v ER, který se má monitorovat skládání bílkovin.

Jakmile je protein správně složen, jsou odstraněny dva zbytky glukózy glukosidáza I a II. Odstranění posledního třetího zbytku glukózy signalizuje, že glykoprotein je připraven k přenosu z ER do cis-Golgi.[4] . ER manosidáza katalyzuje odstranění této konečné glukózy. Pokud však protein není správně složen, nejsou odstraněny zbytky glukózy, a tak glykoprotein nemůže opustit endoplazmatické retikulum. A garde bílkoviny (kalnexin /kalretikulin ) váže se na rozložený nebo částečně složený protein, aby pomohl skládání proteinu.

Další krok zahrnuje další přidání a odstranění zbytků cukru v cis-Golgi. Tyto modifikace jsou katalyzovány glykosyltransferázami a glykosidázami. V cis-Golgi, řada mannosidáz odstraňuje některé nebo všechny čtyři manosové zbytky ve vazbách α-1,2.[4] Zatímco v mediální části Golgiho glykosyltransferázy přidávají zbytky cukru ke struktuře jádra glykanu, čímž vznikají tři hlavní typy glykanů: vysoký obsah manózy, hybridní a komplexní glykany.

Tři hlavní typy glykanů.
  • High-mannose jsou v podstatě jen dva N-acetylglukosaminy s mnoha zbytky manózy, často téměř tolik, kolik je pozorováno v prekurzorových oligosacharidech před jeho připojením k proteinu.
  • Komplexní oligosacharidy jsou tak pojmenovány, protože mohou obsahovat téměř jakýkoli počet dalších typů sacharidů, včetně více než původních dvou N-acetylglukosaminy.
  • Hybridní oligosacharidy obsahují manosové zbytky na jedné straně větve, zatímco na druhé straně a N-acetylglukosamin iniciuje komplexní větev.

Pořadí přidávání cukrů k rostoucím glykanovým řetězcům je určeno specifičností substrátů enzymů a jejich přístupem k substrátu při jejich pohybu sekreční cesta. Organizace tohoto aparátu v buňce tedy hraje důležitou roli při určování, které glykany se vyrábějí.

Enzymy v Golgi

Golgiho enzymy hrají klíčovou roli při určování syntézy různých typů glykanů. Pořadí působení enzymů se odráží v jejich poloze v Golgiho zásobníku:

EnzymyMísto v Golgi
Mannosidáza Icis-Golgi
GlcNAc transferázymediální Golgi
Galaktosyltransferáza a Sialyltransferázatrans-Golgi

U archaea a prokaryot

Podobný NCesta biosyntézy glykanu byla nalezena u prokaryot a Archea.[6] Ve srovnání s eukaryoty se však nezdá, že by se konečná glykánová struktura v eubakteriích a archaeách příliš lišila od počátečního prekurzoru vytvořeného v endoplazmatickém retikulu. U eukaryot je původní prekurzorový oligosacharid značně modifikován na cestě k buněčnému povrchu.[4]

Funkce

Nvázané glykany mají vnitřní a vnější funkce.[4]

V rámci imunitního systému Nnavázané glykany na povrchu imunitní buňky pomohou diktovat migrační vzorec buňky, např. imunitní buňky, které migrují do kůže, mají specifické glykosylace, které upřednostňují navádění na dané místo.[7] Glykosylační vzorce na různých imunoglobulinech včetně IgE, IgM, IgD, IgA a IgG jim propůjčují jedinečné efektorové funkce tím, že mění jejich afinitu k Fc a dalším imunitním receptorům.[7] Glykany mohou být také zapojeny do diskriminace „já“ a „ne sebe“, což může být relevantní pro patofyziologii různých autoimunitních onemocnění.[7]

Funkce Nvázané glykany
Vnitřní
  1. Poskytuje strukturní komponenty buněčné stěně a extracelulární matrici.
  2. Upravte vlastnosti bílkovin, jako je stabilita a rozpustnost[8] (stabilnější vůči vysoké teplotě, pH atd.).
Vnější
  1. Usměrňuje obchodování s glykoproteiny.
  2. Zprostředkovává buněčnou signalizaci (interakce buňka-buňka a buňka-matice).

Klinický význam

Změny v Nnavázaná glykosylace byla spojena s různými nemocemi včetně revmatoidní artritida,[9] cukrovka 1. typu,[10] Crohnova nemoc,[11] a rakoviny.[12][13]

Mutace v osmnácti genech zapojených do Nnavázaná glykosylace vede k řadě onemocnění, z nichž většina zahrnuje nervový systém.[3][13]

Význam terapeutických proteinů

Mnoho terapeutický bílkoviny na trhu jsou protilátky, což jsou Nspojené glykoproteiny. Například, Etanercept, Infliximab a Rituximab jsou N-glykosylované terapeutické proteiny.

Rozdíl mezi glykanem produkovaným lidmi a živočišnými buňkami. Lidské buňky nemají krytku Neu5Gc.

Důležitost Nglykosylace spojená s vazbami je stále více zřejmá v oboru léčiva.[14] Ačkoli bakteriální nebo kvasinky produkce bílkovin systémy mají významné potenciální výhody, jako je vysoký výtěžek a nízké náklady, nastávají problémy, když je zájmovým proteinem glykoprotein. Většina prokaryotických expresních systémů, jako je E-coli nemůže provést posttranslační úpravy. Na druhé straně, eukaryotičtí expresní hostitelé, jako jsou kvasinky a zvířecí buňky, mají různé glykosylační vzorce. Proteiny produkované v těchto expresních hostitelích často nejsou totožné s lidským proteinem, a proto jsou příčinou imunogenní reakce u pacientů. Například, S. cerevisiae (kvasinky) často produkují vysoce manosové glykany, které jsou imunogenní.

Nehumánní savčí expresní systémy, jako jsou CHO nebo Buňky NS0 mít potřebné vybavení pro přidávání komplexních glykanů lidského typu. Glykany produkované v těchto systémech se však mohou lišit od glykanů produkovaných u lidí, protože mohou být uzavřeny oběma N-glykolylneuraminová kyselina (Neu5Gc) a N-acetylneuraminová kyselina (Neu5Ac), zatímco lidské buňky produkují pouze glykoproteiny obsahující N-acetylneuraminová kyselina. Kromě toho mohou zvířecí buňky také produkovat glykoproteiny obsahující galaktóza-alfa-1,3-galaktóza epitop, který může vyvolat závažné alergenní reakce, včetně anafylaktický šok u lidí, kteří mají Alfa-gal alergie.

Tyto nevýhody byly vyřešeny několika přístupy, jako je eliminace drah, které produkují tyto glykanové struktury prostřednictvím genetických knockoutů. Kromě toho byly geneticky upraveny další expresní systémy k produkci terapeutických glykoproteinů podobných člověku Nvázané glykany. Patří mezi ně kvasinky jako Pichia pastoris,[15] buněčné linie hmyzu, zelené rostliny,[16] a dokonce i bakterie.

Viz také

Reference

  1. ^ "Glykosylace". UniProt: Sekvence proteinů a funkční informace.
  2. ^ Imperiali B, O'Connor SE (prosinec 1999). "Účinek N-vázaná glykosylace na glykopeptidové a glykoproteinové struktuře ". Aktuální názor na chemickou biologii. 3 (6): 643–9. doi:10.1016 / S1367-5931 (99) 00021-6. PMID  10600722.
  3. ^ A b Patterson MC (září 2005). "Metabolické napodobeniny: poruchy N-vázaná glykosylace ". Semináře z dětské neurologie. 12 (3): 144–51. doi:10.1016 / j.spen.2005.10.002. PMID  16584073.
  4. ^ A b C d E F G h i j k l m n Ó p Drickamer K, Taylor ME (2006). Úvod do glykobiologie (2. vyd.). Oxford University Press, USA. ISBN  978-0-19-928278-4.
  5. ^ Mellquist JL, Kasturi L, Spitalnik SL, Shakin-Eshleman SH (květen 1998). „Aminokyselina následující po sekvenci Asn – X – Ser / Thr je důležitým determinantem N- účinnost glykosylace spojeného jádra ". Biochemie. 37 (19): 6833–7. doi:10.1021 / bi972217k. PMID  9578569.
  6. ^ Dell A, Galadari A, Sastre F, Hitchen P (2010). „Podobnosti a rozdíly v mechanismech glykosylace u prokaryot a eukaryot“. International Journal of Microbiology. 2010: 1–14. doi:10.1155/2010/148178. PMC  3068309. PMID  21490701.
  7. ^ A b C Maverakis E, Kim K, Shimoda M, Gershwin ME, Patel F, Wilken R a kol. (Únor 2015). „Glykany v imunitním systému a The Altered Glycan Theory of Autoimmunity: a critical review“. Časopis autoimunity. 57 (6): 1–13. doi:10.1016 / j.jaut.2014.12.002. PMC  4340844. PMID  25578468.
  8. ^ Sinclair AM, Elliott S (srpen 2005). „Glykoinženýrství: účinek glykosylace na vlastnosti terapeutických proteinů“. Journal of Pharmaceutical Sciences. 94 (8): 1626–35. doi:10.1002 / jps.20319. PMID  15959882.
  9. ^ Nakagawa H, Hato M, Takegawa Y, Deguchi K, Ito H, Takahata M a kol. (Červen 2007). „Detekce změněných N-glykanové profily v celém séru pacientů s revmatoidní artritidou ". Journal of Chromatography B. 853 (1–2): 133–7. doi:10.1016 / j.jchromb.2007.03.003. hdl:2115/28276. PMID  17392038.
  10. ^ Bermingham ML, Colombo M, McGurnaghan SJ, Blackbourn LA, Vučković F, Pučić Baković M a kol. (Leden 2018). "N-Glykanový profil a onemocnění ledvin u diabetu 1. typu ". Péče o cukrovku. 41 (1): 79–87. doi:10.2337 / dc17-1042. PMID  29146600.
  11. ^ Trbojević Akmačić I, Ventham NT, Theodoratou E, Vučković F, Kennedy NA, Krištić J a kol. (Červen 2015). „Zánětlivé onemocnění střev souvisí s prozánětlivým potenciálem imunoglobulinu G glycome“. Zánětlivá onemocnění střev. 21 (6): 1237–47. doi:10.1097 / MIB.0000000000000372. PMC  4450892. PMID  25895110.
  12. ^ Kodar K, Stadlmann J, Klaamas K, Sergeyev B, Kurtenkov O (leden 2012). „Imunoglobulin G Fc Nprofil glykanu u pacientů s rakovinou žaludku metodou LC-ESI-MS: vztah k progresi a přežití nádoru “. Glycoconjugate Journal. 29 (1): 57–66. doi:10.1007 / s10719-011-9364-z. PMID  22179780.
  13. ^ A b Chen G, Wang Y, Qin X, Li H, Guo Y, Wang Y a kol. (Srpen 2013). "Změna IgG1 Fc Nsouvisející glykosylace u lidské rakoviny plic: diagnostický potenciál související s věkem a pohlavím ". Elektroforéza. 34 (16): 2407–16. doi:10.1002 / elps.201200455. PMID  23766031.
  14. ^ Dalziel M, Crispin M, Scanlan CN, Zitzmann N, Dwek RA (leden 2014). "Nové zásady pro terapeutické využití glykosylace". Věda. 343 (6166): 1235681. doi:10.1126 / science.1235681. PMID  24385630.
  15. ^ Hamilton SR, Bobrowicz P, Bobrowicz B, Davidson RC, Li H, Mitchell T a kol. (Srpen 2003). "Produkce komplexních lidských glykoproteinů v kvasnicích". Věda. 301 (5637): 1244–6. doi:10.1126 / science.1088166. PMID  12947202.
  16. ^ Strasser R, Altmann F, Steinkellner H (prosinec 2014). "Řízená glykosylace rostlinných produkovaných rekombinantních proteinů". Aktuální názor na biotechnologie. 30: 95–100. doi:10.1016 / j.copbio.2014.06.008. PMID  25000187.

externí odkazy