Reportér gen - Reporter gene
![]() | tento článek chybí informace o historii subjektu.Leden 2012) ( |

v molekulární biologie, a reportér gen (často jednoduše zpravodaj) je gen které vědci připojují k regulační sekvence jiného požadovaného genu v bakterie, buněčná kultura, zvířata nebo rostliny. Takovým genům se říká reportéři, protože vlastnosti, které propůjčují organismům, které je exprimují, lze snadno identifikovat a měřit, nebo proto, že jsou volitelné značky. Reportérové geny se často používají jako indikace toho, zda byl určitý gen absorbován nebo exprimován v populaci buněk nebo organismů.
Společné reportérové geny
K zavedení reportérového genu do organismu vědci umístí reportérový gen a požadovaný gen do stejného DNA konstrukt které mají být vloženy do buňky nebo organismu. Pro bakterie nebo prokaryotické buňky v kultuře je to obvykle ve formě kruhové molekuly DNA zvané a plazmid. Je důležité použít reportérový gen, který není nativně exprimován ve studované buňce nebo organismu, protože exprese reportéru se používá jako marker pro úspěšné vychytávání požadovaného genu.[1]
Běžně používané reportérové geny, které indukují vizuálně identifikovatelné vlastnosti, obvykle zahrnují fluorescenční a světélkující bílkoviny. Mezi příklady patří gen, který kóduje medúzy zelený fluorescenční protein (GFP), který způsobuje buňky které to vyjadřují, aby zářily zeleně pod modrým světlem, enzymem luciferáza, který katalyzuje reakci s luciferin produkovat světlo a červený fluorescenční protein z genu dsRed .[2][3][4][5][6] The GUS Gen byl běžně používán v rostlinách, ale luciferáza a GFP jsou stále častější.[7][8]
Běžným reportérem bakterií je E-coli lacZ gen, který kóduje protein beta-galaktosidáza.[9] Tento enzym způsobí, že bakterie exprimující gen vypadají modře, když rostou na médiu, které obsahuje analog substrátu X-gal. Příkladem selekčního markeru, který je také reportérem bakterií, je chloramfenikol acetyltransferáza (CAT) gen, který propůjčuje rezistenci vůči antibiotiku chloramfenikol.[10]
Genové jméno | Genový produkt | Test | Čj. |
---|---|---|---|
lacZ | β-galaktosidáza | Enzymový test, histochemický | [9] |
kočka | Chloramfenikol acetyltransferáza | Chloramfenikol acetylace | [10] |
gfp | Zelený fluorescenční protein | Fluorescenční | [2] |
rfp | Červený fluorescenční protein | Mikroskopický, Spektrofotometrie | [11] |
luc | Enzym luciferázy | Bioluminiscence | [3] |
Testy transformace a transfekce
Mnoho metod transfekce a proměna - dva způsoby exprese cizího nebo modifikovaného genu v organismu - jsou účinné pouze u malého procenta populace podrobené těmto technikám.[12][13] Je tedy nezbytný způsob identifikace těchto několika úspěšných událostí absorpce genů. Reportérové geny použité tímto způsobem jsou obvykle exprimovány svými vlastními promotér (Oblasti DNA, které iniciují transkripci genů) nezávisle na oblasti zavedeného požadovaného genu; může být exprimován reportérový gen konstitutivně (tj. je „vždy zapnuto“) nebo indukovatelně externím zásahem, jako je zavedení Isopropyl β-D-1-thiogalaktopyranosid (IPTG) v systému β-galaktosidázy.[9] Výsledkem je, že exprese reportérového genu je nezávislá na expresi sledovaného genu, což je výhodou, když je sledovaný gen exprimován pouze za určitých specifických podmínek nebo ve tkáních, které jsou obtížně přístupné.[1]
V případě reportérů selekčních markerů, jako je CAT, může být transfektovaná populace bakterií pěstována na substrátu, který obsahuje chloramfenikol. Pouze ty buňky, které úspěšně přijaly konstrukt obsahující gen CAT, přežijí a množí se za těchto podmínek.[10]
Testy genové exprese
Reportérové geny lze použít k testování exprese požadovaného genu, který je obvykle obtížné kvantitativně stanovit.[1] Reportérové geny mohou produkovat protein, který má malý zjevný nebo okamžitý účinek na buněčnou kulturu nebo organismus. V ideálním případě nejsou přítomny v nativním genomu, aby bylo možné izolovat expresi reportérového genu v důsledku exprese požadovaného genu.[1][14]
K aktivaci reportérových genů je lze exprimovat konstitutivně, kde jsou přímo připojeny ke genu zájmu, aby vytvořily a genová fúze.[15] Tato metoda je příkladem použití cis-herectví prvky, kde jsou dva geny pod stejnými promotorovými prvky a jsou přepsal do jednoho messenger RNA molekula. The mRNA je tedy přeloženo na bílkoviny. Je důležité, aby oba proteiny dokázaly správně složit do svých aktivních konformací a interagovat s jejich substráty, přestože jsou spojeny. Při vytváření konstruktu DNA je obvykle zahrnut segment DNA kódující flexibilní oblast polypeptidového linkeru, takže reportér a genový produkt budou vzájemně interferovat pouze minimálně.[16][17] Reporterové geny mohou být také exprimovány pomocí indukce během růstu. V těchto případech trans-herectví prvky, jako např transkripční faktory se používají k expresi reportérového genu.[18][19]
Test reportérového genu se stále častěji používá vysoce propustný screening (HTS) k identifikaci malých molekulárních inhibitorů a aktivátorů proteinových cílů a drah pro objev drog a chemická biologie. Protože reportér sám enzymy (např. Světluška luciferáza ) mohou být přímými cíli malých molekul a zmást interpretaci dat HTS, byly vyvinuty nové návrhy reportérů koincidence zahrnující potlačení artefaktů.[20][21]
Promotérské testy
Reportérové geny mohou být použity k testování aktivity konkrétního promotoru v buňce nebo organismu.[22] V tomto případě neexistuje žádný samostatný „sledovaný gen“; reportérový gen je jednoduše umístěn pod kontrolu cílového promotoru a aktivita produktu reportérového genu je kvantitativně měřena. Výsledky jsou obvykle uváděny ve vztahu k aktivitě za "konsensuálního" promotoru, o kterém je známo, že indukuje silnou genovou expresi.[23]
Další použití
Složitější využití reportérových genů ve velkém měřítku je v dvouhybridní screening, jehož cílem je identifikovat proteiny, které mezi sebou nativně interagují in vivo.[24]
Viz také
Reference
- ^ A b C d Debnath, Mousumi; Prasad, Godavarthi B.K.S .; Bisen, Prakash S. (2010), Debnath, Mousumi; Prasad, Godavarthi B.K.S .; Bisen, Prakash S. (ed.), „Reporter Gene“, Molekulární diagnostika: sliby a možnosti, Springer Nizozemsko, s. 71–84, doi:10.1007/978-90-481-3261-4_5, ISBN 978-90-481-3261-4
- ^ A b Soboleski, Mark R .; Oaks, Jason; Halford, William P. (březen 2005). „Zelený fluorescenční protein je kvantitativní reportér genové exprese v jednotlivých eukaryotických buňkách“. FASEB Journal. 19 (3): 440–442. doi:10.1096 / fj.04-3180fje. ISSN 0892-6638. PMC 1242169. PMID 15640280.
- ^ A b Smale, S. T. (2010-05-01). „Luciferase Assay“. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (5): pdb.prot5421. doi:10.1101 / pdb.prot5421. ISSN 1559-6095. PMID 20439408.
- ^ Jach, Guido; Binot, Elke; Frings, Sabine; Luxa, Kerstin; Schell, Jeff (2001). "Použití červeného fluorescenčního proteinu z Discosoma sp. (DsRED) jako reportéru exprese rostlinného genu". The Plant Journal. 28 (4): 483–491. doi:10.1046 / j.1365-313X.2001.01153.x. ISSN 1365-313X. PMID 11737785.
- ^ Zhang, Qixiang; Walawage, Sriema L .; Tricoli, David M .; Dandekar, Abhaya M .; Leslie, Charles A. (květen 2015). "Červený fluorescenční protein (DsRED) z Discosoma sp. Jako reportér genové exprese v somatických embryích vlašských ořechů". Zprávy rostlinných buněk. 34 (5): 861–869. doi:10.1007 / s00299-015-1749-1. ISSN 1432-203X. PMID 25627255. S2CID 9184712.
- ^ Mikkelsen, Lisbeth; Sarrocco, Sabrina; Lübeck, Mette; Jensen, Dan Funck (01.06.2003). "Exprese červeného fluorescenčního proteinu DsRed-Express ve vláknitých houbách ascomycete". Mikrobiologické dopisy FEMS. 223 (1): 135–139. doi:10.1016 / S0378-1097 (03) 00355-0. ISSN 0378-1097. PMID 12799012.
- ^ Hull, Gillian A .; Devic, Martine (1995), Jones, Heddwyn (ed.), „Reporterový genový systém β-glukuronidázy (gus)“, Protokoly přenosu a exprese rostlin, Methods in Molecular Biology ™, Springer New York, 49, str. 125–141, doi:10,1385 / 0-89603-321-x: 125, ISBN 978-1-59259-536-5, PMID 8563799
- ^ Koo, J .; Kim, Y .; Kim, J .; Yeom, M .; Lee, I.C .; Nam, H. G. (2007). „Reportér fúze GUS / luciferáza pro zachycení rostlinných genů a pro stanovení aktivity promotoru s kontrolou stability reportérového proteinu závislou na luciferinu“. Fyziologie rostlin a buněk. 48 (8): 1121–1131. doi:10,1093 / pcp / pcm081. PMID 17597079.
- ^ A b C Smale, S. T. (2010-05-01). "-Galaktosidázový test". Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (5): pdb.prot5423. doi:10.1101 / pdb.prot5423. ISSN 1559-6095. PMID 20439410.
- ^ A b C Smale, S. T. (2010-05-01). „Stanovení chloramfenikol acetyltransferázy“. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (5): pdb.prot5422. doi:10.1101 / pdb.prot5422. ISSN 1559-6095. PMID 20439409.
- ^ Nordgren, I. K .; Tavassoli, A (2014). „Obousměrný fluorescenční dvouhybridní systém pro sledování interakcí protein-protein“. Molekulární biosystémy. 10 (3): 485–90. doi:10.1039 / c3mb70438f. PMID 24382456.
- ^ Hanahan, Douglas; Jessee, Joel; Bloom, Fredric R. (1991-01-01), „[4] Plazmidová transformace Escherichia coli a jiných bakterií“, Metody v enzymologiiBakteriální genetické systémy, akademický tisk, 204: 63–113, doi:10.1016 / 0076-6879 (91) 04006-a, ISBN 9780121821050, PMID 1943786
- ^ Hanahan, Douglas (06.06.1983). "Studie transformace Escherichia coli plazmidy". Journal of Molecular Biology. 166 (4): 557–580. doi:10.1016 / S0022-2836 (83) 80284-8. ISSN 0022-2836. PMID 6345791.
- ^ Promega Corporation, Promega Corporation (22. října 2014). „Úvod do stanovení genů pro reportéry“. Youtube. Citováno 21. března, 2020.
- ^ de Jong, Hidde; Geiselmann, Johannes (2015). Maler, Oded; Halász, Ádám; Dang, Thao; Piazza, Carla (eds.). „Fluorescent Reporter Genes and the Analysis of Bacterial Regulatory Networks“. Biologie hybridních systémů. Přednášky z informatiky. Springer International Publishing. 7699: 27–50. doi:10.1007/978-3-319-27656-4_2. ISBN 978-3-319-27656-4.
- ^ Spector, David L .; Goldman, Robert D. (01.12.2006). "Konstrukce a exprese proteinů fúze GFP". Protokoly CSH. 2006 (7): pdb.prot4649. doi:10.1101 / pdb.prot4649. PMID 22484672.
- ^ Chen, Xiaoying; Zaro, Jennica; Shen, Wei-Chiang (15.10.2013). „Fúzní proteinové linkery: vlastnost, design a funkčnost“. Recenze pokročilého doručování drog. 65 (10): 1357–1369. doi:10.1016 / j.addr.2012.09.039. ISSN 0169-409X. PMC 3726540. PMID 23026637.
- ^ Hanko, Erik K. R .; Minton, Nigel P .; Malys, Naglis (01.01.2019), Shukla, Arun K. (vyd.), „Kapitola devátá - Návrh, klonování a charakterizace systémů indukovatelných genových expresí založených na transkripčním faktoru“, Metody v enzymologiiPřístupy chemické a syntetické biologie k porozumění buněčným funkcím - část A, akademický tisk, 621: 153–169, doi:10.1016 / bs.mie.2019.02.018, PMID 31128776, vyvoláno 2019-12-16
- ^ Kallunki, Tuula; Barisic, Marin; Jäättelä, Marja; Liu, Bin (2019-07-30). „Jak si vybrat ten správný indukovatelný systém genové exprese pro studia savců?“. Buňky. 8 (8): 796. doi:10,3390 / buňky8080796. ISSN 2073-4409. PMC 6721553. PMID 31366153.
- ^ Cheng, K.C .; Inglese, J. (2012). „Systém shody náhodných reportérů a genů pro vysoce výkonný screening“. Přírodní metody. 9 (10): 937. doi:10.1038 / nmeth.2170. PMC 4970863. PMID 23018994.
- ^ Hasson, S.A .; Fogel, A.I .; Wang, C .; MacArthur, R .; Guha, R .; Heman-Ackahc, S .; Martin, S .; Youle, R.J .; Inglese, J. (2015). "Chemogenomické profilování endogenní exprese PARK2 pomocí reportéru koincidence upraveného genomem". ACS Chem. Biol. 10 (5): 1188–1197. doi:10.1021 / cb5010417. PMID 25689131.
- ^ Jugder, Bat-Erdene; Welch, Jeffrey; Braidy, Nady; Markýz, Christopher P. (2016-07-26). „Konstrukce a použití fúze agupriavidus necatorH16 rozpustného promotoru hydrogenázy (PSH) s togfp (zelený fluorescenční protein)“. PeerJ. 4: e2269. doi:10,7717 / peerj.2269. ISSN 2167-8359. PMC 4974937. PMID 27547572.
- ^ Solberg, Nina; Krauss, Stefan (2013). "Luciferázový test ke studiu aktivity klonovaného fragmentu DNA promotoru". Regulace genů. Metody v molekulární biologii (Clifton, N.J.). 977. str. 65–78. doi:10.1007/978-1-62703-284-1_6. ISBN 978-1-62703-283-4. ISSN 1940-6029. PMID 23436354.
- ^ Brückner, Anna; Polge, Cécile; Lentze, Nicolas; Auerbach, Daniel; Schlattner, Uwe (2009-06-18). „Kvasinky Two-Hybrid, výkonný nástroj pro biologii systémů“. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6): 2763–2788. doi:10,3390 / ijms10062763. ISSN 1422-0067. PMC 2705515. PMID 19582228.
externí odkazy
- Hlavní body výzkumu a aktualizované informace o reportérských genech.
- Barvení embryí celé myši na aktivitu β-galaktosidázy (lacZ)