Modely isogenních lidských onemocnění - Isogenic human disease models

Modely isogenních lidských onemocnění jsou rodina buněk, které jsou vybrány nebo zkonstruovány tak, aby přesně modelovaly genetika konkrétní populace pacientů, in vitro. Jsou vybaveny geneticky sladěnou „normální buňkou“, která poskytuje izogenní systém pro výzkum biologie nemocí a nových terapeutických látek.^[1] Mohou být použity k modelování jakékoli nemoci s genetickým základem. Rakovina je jedno takové onemocnění, pro které byly široce používány modely isogenních lidských onemocnění.

Historické modely

Modely lidských isogenních onemocnění byly přirovnávány k „pacientům ve zkumavce“, protože obsahují nejnovější výzkum lidských genetických chorob a dělají to bez obtíží a omezení při používání nehumánních modelů.^[2]

Historicky byly buňky získané ze zvířat, typicky myší, použity k modelování cest souvisejících s rakovinou. Existují však zjevná omezení spojená s používáním zvířat k modelování geneticky podmíněných chorob u lidí. Navzdory velkému podílu genetické ochrany mezi lidmi a myšmi existují významné rozdíly mezi biologií myší a lidí, které jsou důležité pro výzkum rakoviny. Například hlavní rozdíly v telomer regulace umožňuje myším buňkám obejít požadavek na telomeráza upregulace, což je krok omezující rychlost při tvorbě lidské rakoviny. Jako další příklad jsou určité interakce ligand-receptor nekompatibilní mezi myší a lidmi. Pokusy navíc prokázaly důležité a významné rozdíly ve schopnosti transformovat buňky ve srovnání s buňkami myšího původu. Z těchto důvodů zůstává zásadní vyvinout modely rakoviny, které využívají lidské buňky.^[3]

Cílené vektory

Isogenní buněčné linie jsou vytvářeny procesem nazývaným homologní genové cílení. Cílové vektory, které využívají homologní rekombinaci, jsou nástroje nebo techniky, které se používají k vyřazení nebo vyřazení požadované mutace způsobující onemocnění nebo SNP (polymorfismus jednoho nukleotidu ) ke studiu. Přestože lze mutace choroby získat přímo od pacientů s rakovinou, tyto buňky obvykle obsahují mnoho dalších mutací pozadí kromě specifické požadované mutace a odpovídající normální buněčná linie se obvykle nezíská. Následně se vektory cílení používají k 'knock-in 'nebo'knock out „genové mutace umožňující přepnutí v obou směrech; z normálního na genotyp rakoviny; nebo naopak; u charakterizovaných buněčných linií lidské rakoviny, jako je HCT116 nebo Nalm6.^[4]

K inženýrství požadované mutace se používá několik technologií zaměřených na gen, z nichž nejběžnější jsou stručně popsány, včetně klíčových výhod a omezení, v souhrnné tabulce níže.

Technika	Gene Knock-In	Gene knock-out
rAAV (rekombinantní adeno-asociované virové vektory)^[5]	Cílené inzerce nebo modifikace jsou vytvářeny v endogenních genech; a proto podléhají: Správné mechanismy genové regulace; a Přesně odrážejí události onemocnění zjištěné u skutečných pacientů. rAAV může zavádět jemné bodové mutace, SNP i malé inzerce s vysokou účinností. Kromě toho mnoho recenzovaných studií ukázalo, že rAAV nezavádí žádné matoucí mimo cílové genomové události.^{[Citace je zapotřebí ]} Zdá se, že je preferovanou metodou přijímanou v akademické sféře, Biotech a Pharma na základě přesnosti versus čas versus náklady.^{[Citace je zapotřebí ]}\|	Genové knockouty jsou na endogenním místě, a proto jsou definitivní, stabilní a relevantní pro pacienta. U jiných genomových lokusů nejsou vyvolány žádné matoucí účinky mimo cíl. Vyžaduje dvoufázový proces: Vytvořte heterozygotní KO Vytvořte bialelický knockout zaměřením na druhou alelu. Tento proces proto může generovat 3 genotypy (+ / +; - / + a - / -); umožňující tedy analýzu haplo-nedostatečné genové funkce. Současným omezením je potřeba postupného cílení na jednotlivé alely, takže generování knock-out buněčných linií je dvoustupňový proces.
Homologní rekombinace na bázi plazmidu	Vkládání je na endogenním místě a má všechny výše uvedené výhody, ale je velmi neúčinné. Vyžaduje také strategii výběru léků bez promotoru, která zahrnuje generování konstruktů na míru. Pomocí této metody byla vytvořena velká historická banka buněčných linií, která byla od poloviny 90. let nahrazena jinými metodami.	Odstranění je na endogenním místě a má všechny výše uvedené výhody, ale je neúčinné. Vyžaduje také strategii výběru léků bez promotorů, která zahrnuje generování konstruktů na míru
Flip-in	Jedná se o efektivní techniku, která umožňuje cílené vkládání „ektopických“ transgenů do jednoho předem definovaného genomového lokusu (integrace prostřednictvím FLP rekombináza stránky). Toto není technika pro modifikaci endogenního lokusu. Transgeny budou obvykle pod kontrolou exogenního promotoru nebo částečně definované promotorové jednotky v nesprávném genomickém umístění. Jejich exprese proto nebude pod stejnou genomovou a epigenetickou regulací jako endogenní lokusy, což omezuje užitečnost těchto systémů pro studium genové funkce. Jsou však dobré pro vyvolání rychlé a stabilní exogenní genové exprese.	Nelze použít
Nukleázy ze zinku (ZFN)	Bylo hlášeno, že ZFN dosahují vysoké míry genetických knock-outů v cílovém endogenním genu. Pokud jsou ZFN dodávány společně s transgenním konstruktem homologním s cílovým genem, lze také dosáhnout genetického knock-inu nebo inzerce.^[6] Jednou z potenciálních nevýhod je, že jakékoli dvouvláknové zlomení mimo cíl by mohlo vést k náhodným vložením, delecím a širší genomické nestabilitě mimo cíl; matoucí výsledný genotyp.^[7] Nebylo však pozorováno žádné měřitelné zvýšení rychlosti náhodné integrace plazmidu v lidských buňkách účinně upravovaných pomocí ZFN, které cílí na kompozitní 24 bp rozpoznávací místo ^[6]	ZFN jsou sekvenčně řízené endonukleázy, které umožňují rychlé a vysoce účinné (až 90% v populaci buněčných buněk) narušení obou alel cílového genu, i když u uživatelů nebyly hlášeny žádné změny funkce nebo relevantní změny funkce podobné frekvence. Mimo cílené delece nebo inzerce jinde v genomu jsou významným problémem. Rychlostní výhoda získání bialelického KO v jednom kroku je také částečně zmírněna, pokud je stále potřeba odvodit klonální buněčnou linii ke studiu genové funkce v homogenní buněčné populaci.
Meganukleázy	Meganukleázy jsou provozně analogické se ZFN. Existují omezení spojená s jejich použitím, například design vektoru meganukleázy, který může trvat až 9 měsíců a stát desítky tisíc dolarů.^{[Citace je zapotřebí ]} Díky tomu jsou meganukleázy atraktivnější při vysoce hodnotných aplikacích, jako je genová terapie, agrobiotechnologie a inženýrství linií bioproduktů.

Homologní rekombinace na modelech onemocnění rakovinných buněk

Homologní rekombinace (HR) je druh genetické rekombinace, při které jsou genetické sekvence vyměňovány mezi dvěma podobnými segmenty DNA. HR hraje hlavní roli v dělení eukaryotických buněk, podporuje genetickou rozmanitost prostřednictvím výměny mezi odpovídajícími segmenty DNA a vytváří nové a potenciálně prospěšné kombinace genů.

HR plní druhou zásadní roli v opravě DNA, což umožňuje opravu dvouřetězcových zlomů v DNA, které se běžně vyskytují během životního cyklu buňky. Je to tento proces, který je uměle spouštěn výše uvedenými technologiemi a bootstrapován za účelem vyvolání „knock-inů“ nebo „knockoutů“ ve specifických genech5, 7.

Nedávný klíčový pokrok byl objeven pomocí AAV-homologních rekombinačních vektorů, které zvyšují nízké přirozené rychlosti HR v diferencovaných lidských buňkách, když jsou kombinovány s vektory-sekvencemi vektorů zaměřených na gen.

Schéma typického vektoru rAAV (zdroj: https://www.horizondiscovery.com/gene-editing/raav )

Komercializace

Faktory vedoucí k nedávné komercializaci modelů isogenních lidských rakovinných buněk pro farmaceutický průmysl a výzkumné laboratoře jsou dvojí.

Zaprvé, úspěšné patentování vylepšené vektorové technologie cílení poskytlo základ pro komercializaci buněčných modelů, které vycházejí z aplikace těchto technologií.

Zadruhé, trend relativně nízké úspěšnosti farmaceutického RnD a enormní náklady vytvořily skutečnou potřebu nových výzkumných nástrojů, které nedovolují, jak budou podskupiny pacientů reagovat pozitivně nebo budou rezistentní vůči cílené léčbě rakoviny na základě jejich individuálního genetického profilu.

Na řešení této potřeby pracuje několik společností. Níže uvádíme seznam klíčových hráčů a jejich technologických nabídek.

Viz také

Reference

^ Torrance CJ, Agrawal V, Vogelstein B, Kinzler KW (říjen 2001). „Použití isogenních lidských rakovinných buněk k vysoce výkonnému screeningu a objevu léků“. Nat. Biotechnol. 19 (10): 940–5. doi:10.1038 / nbt1001-940. PMID 11581659.
^ Gupta, Piyush B .; Kuperwasser, Charlotte (2004). "Chorobné modely rakoviny prsu". Objev drog dnes. 1: 9–16. doi:10.1016 / j.ddmod.2004.05.001.
^ Hirata R, Chamberlain J, Dong R, Russell DW (červenec 2002). "Cílená inzerce transgenu do lidských chromozomů adeno-asociovanými virovými vektory". Nat. Biotechnol. 20 (7): 735–8. doi:10.1038 / nbt0702-735. PMID 12089561.
^ Masters JR (prosinec 2000). "Lidské rakovinové buněčné linie: skutečnost a fantazie". Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (3): 233–6. doi:10.1038/35043102. PMID 11252900.
^ Engelhardt JF (srpen 2006). "AAV zasáhne genomické středové oko". Nat. Biotechnol. 24 (8): 949–50. doi:10.1038 / nbt0806-949. PMID 16900138.
^ ^A ^b Urnov, Fyodor D .; Rebar, Edward J .; Holmes, Michael C .; Zhang, H. Steve; Gregory, Philip D. (2010). "Úpravy genomu s vytvořenými nukleázami zinkových prstů". Genetika hodnocení přírody. 11 (9): 636–646. doi:10.1038 / nrg2842. PMID 20717154.
^ Radecke S, Radecke F, Cathomen T, Schwarz K (duben 2010). „Oprava genu nukleázou indukovanou zinkovým prstem pomocí oligodeoxynukleotidů: požadované a nežádoucí úpravy cílového lokusu“. Mol. Ther. 18 (4): 743–53. doi:10,1038 / mt.2009,304. PMC 2862519. PMID 20068556.

Zprávy

Zdroje

Bardelli A, Parsons DW, Silliman N, et al. (Květen 2003). „Mutační analýza tyrosinkinomu u kolorektálních karcinomů“. Věda. 300 (5621): 949. doi:10.1126 / science.1082596. PMID 12738854.
Kohli M, Rago C, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B (2004). „Snadné metody generování knockoutů genů lidských somatických buněk pomocí rekombinantních adeno-asociovaných virů“. Nucleic Acids Res. 32 (1): 3e – 3. doi:10.1093 / nar / gnh009. PMC 373311. PMID 14704360.
Wang Z, Shen D, Parsons DW a kol. (Květen 2004). "Mutační analýza tyrosin fosfatomu u kolorektálních rakovin". Věda. 304 (5674): 1164–6. doi:10.1126 / science.1096096. PMID 15155950.
Topaloglu O, Hurley PJ, Yildirim O, Civin CI, Bunz F (2005). „Vylepšené metody pro generování knockoutu lidských genových a knockinových buněčných linií“. Nucleic Acids Res. 33 (18): e158. doi:10.1093 / nar / gni160. PMC 1255732. PMID 16214806.
Moroni M, Sartore-Bianchi A, Benvenuti S, Artale S, Bardelli A, Siena S (listopad 2005). „Somatická mutace katalytické domény EGFR a léčba gefitinibem u kolorektálního karcinomu“. Ann. Oncol. 16 (11): 1848–9. doi:10.1093 / annonc / mdi356. PMID 16012179.
Di Nicolantonio F, Bardelli A (leden 2006). „Kinázové mutace v rakovině: praskliny v nepřátelském brnění?“. Curr Opin Oncol. 18 (1): 69–76. doi:10.1097 / 01.cco.0000198020.91724.48. PMID 16357567.
Benvenuti S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F a kol. (Březen 2007). „Onkogenní aktivace signální dráhy RAS / RAF zhoršuje reakci metastatických kolorektálních karcinomů na léčbu protilátkami proti epidermálnímu receptoru růstového faktoru“. Cancer Res. 67 (6): 2643–8. doi:10.1158 / 0008-5472.CAN-06-4158. PMID 17363584.
Arena S, Pisacane A, Mazzone M, Comoglio PM, Bardelli A (červenec 2007). "Genetické cílení na kinázovou aktivitu Met receptoru v rakovinných buňkách". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (27): 11412–7. doi:10.1073 / pnas.0703205104. PMC 2040912. PMID 17595299.
Konishi H, Karakas B, Abukhdeir AM a kol. (Září 2007). „Vyřazení mutantního K-ras v netumorigenních lidských epiteliálních buňkách jako nový model pro studium transformace zprostředkované K-ras“. Cancer Res. 67 (18): 8460–7. doi:10.1158 / 0008-5472.CAN-07-0108. PMID 17875684.
Arena S, Isella C, Martini M, de Marco A, Medico E, Bardelli A (září 2007). „Vyřazení onkogenního Krasa netransformuje myší somatické buňky, ale spouští transkripční reakci, která klasifikuje lidské rakoviny“. Cancer Res. 67 (18): 8468–76. doi:10.1158 / 0008-5472.CAN-07-1126. PMID 17875685.
Grim JE, Gustafson MP, Hirata RK, et al. (Červen 2008). „Odbourávání substrátu závislé na izoformě a buněčném cyklu F ubwitin ligázou Fbw7“. J. Cell Biol. 181 (6): 913–20. doi:10.1083 / jcb.200802076. PMC 2426948. PMID 18559665.
Fattah FJ, Lichter NF, Fattah KR, Oh S, Hendrickson EA (červen 2008). „Ku70, základní gen, moduluje frekvenci rAAV zprostředkovaného genového cílení v lidských somatických buňkách“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (25): 8703–8. doi:10.1073 / pnas.0712060105. PMC 2438404. PMID 18562296.
Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F a kol. (Prosinec 2008). „BRAF divokého typu je vyžadován pro reakci na panitumumab nebo cetuximab u metastatického kolorektálního karcinomu“. J. Clin. Oncol. 26 (35): 5705–12. doi:10.1200 / JCO.2008.18.0786. hdl:2434/349662. PMID 19001320. Archivovány od originál dne 15. 4. 2013.
Di Nicolantonio F, Arena S, Gallicchio M a kol. (Prosinec 2008). „Nahrazení normálu mutantními alelami v genomu normálních lidských buněk odhaluje mutačně specifické lékové odpovědi“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (52): 20864–9. doi:10.1073 / pnas.0808757105. PMC 2634925. PMID 19106301.
Gustin JP, Karakas B, Weiss MB a kol. (Únor 2009). „Knockin mutantní PIK3CA aktivuje více onkogenních drah“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (8): 2835–40. doi:10.1073 / pnas.0813351106. PMC 2636736. PMID 19196980.
Sartore-Bianchi A, Martini M, Molinari F a kol. (Březen 2009). „PIK3CA mutace u kolorektálního karcinomu jsou spojeny s klinickou rezistencí na monoklonální protilátky cílené na EGFR“. Cancer Res. 69 (5): 1851–7. doi:10.1158 / 0008-5472.CAN-08-2466. PMID 19223544.
Sur S, Pagliarini R, Bunz F a kol. (Březen 2009). „Panel isogenních lidských rakovinných buněk navrhuje terapeutický přístup pro rakoviny s inaktivovaným p53“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (10): 3964–9. doi:10.1073 / pnas.0813333106. PMC 2656188. PMID 19225112.
Yun J, Rago C, Cheong I a kol. (Září 2009). „Nedostatek glukózy přispívá k rozvoji mutací dráhy KRAS v nádorových buňkách“. Věda. 325 (5947): 1555–9. doi:10.1126 / science.1174229. PMC 2820374. PMID 19661383.
Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, Nichelatti M, et al. (2009). Cordes N (ed.). „Multi-determinantní analýza molekulárních změn pro předpovědi klinického přínosu pro monoklonální protilátky cílené na EGFR u kolorektálního karcinomu“. PLOS ONE. 4 (10): e7287. doi:10,1371 / journal.pone.0007287. PMC 2750753. PMID 19806185.
Endogenní exprese onkogenní mutace PI3K vede k aktivované signalizaci PI3K a invazivnímu fenotypu Plakát prezentovaný na AACR / EORTC Molecular Targets and Cancer Therapeutics, Boston, USA, listopad 2009
Bardelli A, Siena S (březen 2010). „Molekulární mechanismy rezistence na cetuximab a panitumumab u kolorektálního karcinomu“. J. Clin. Oncol. 28 (7): 1254–61. doi:10.1200 / JCO.2009.24.6116. PMID 20100961. Archivovány od originál dne 15. 4. 2013.
Fattah F, Lee EH, Weisensel N, Wang Y, Lichter N, Hendrickson EA (únor 2010). Pearson CE (ed.). „Ku reguluje nehomologní koncové spojovací cesty výběr opravy dvouvláknového zlomu DNA v lidských somatických buňkách“. PLoS Genet. 6 (2): e1000855. doi:10.1371 / journal.pgen.1000855. PMC 2829059. PMID 20195511.
Buron N, Porceddu M, Brabant M a kol. (2010). Aziz SA (ed.). „Využití mitochondrií lidských rakovinných buněčných linií k prozkoumání mechanismů peptidů BH3 a permeabilizace mitochondriální membrány indukované ABT-737“. PLOS ONE. 5 (3): e9924. doi:10,1371 / journal.pone 0009924. PMC 2847598. PMID 20360986.
Endogenní exprese onkogenní mutace PI3K vede k akumulaci antiapoptotických proteinů v mitochondriích Plakát představený na AACR 2010, Washington, DC, USA, duben. 2010
Použití izogenních buněčných linií „X-MAN“ k definování profilů aktivity inhibitoru PI3-kinázy Plakát představený na AACR 2010, Washington, DC, USA, duben. 2010
Použití mutantu PI3CA „X-MAN“ zvyšuje expresi jednotlivých izoforem tubulinu a podporuje rezistenci na léky proti mitotické chemoterapii Plakát představený na AACR 2010, Washington, DC, USA, duben. 2010
Di Nicolantonio F, Arena S, Tabernero J a kol. (Srpen 2010). „Deregulace signálních drah PI3K a KRAS v lidských rakovinných buňkách určuje jejich reakci na everolimus“. J. Clin. Investovat. 120 (8): 2858–66. doi:10,1172 / JCI37539. PMC 2912177. PMID 20664172.

[1] Torrance CJ, Agrawal V, Vogelstein B, Kinzler KW (říjen 2001). „Použití isogenních lidských rakovinných buněk k vysoce výkonnému screeningu a objevu léků“. Nat. Biotechnol. 19 (10): 940–5. doi:10.1038 / nbt1001-940. PMID 11581659.

[2] Gupta, Piyush B .; Kuperwasser, Charlotte (2004). "Chorobné modely rakoviny prsu". Objev drog dnes. 1: 9–16. doi:10.1016 / j.ddmod.2004.05.001.

[3] Hirata R, Chamberlain J, Dong R, Russell DW (červenec 2002). "Cílená inzerce transgenu do lidských chromozomů adeno-asociovanými virovými vektory". Nat. Biotechnol. 20 (7): 735–8. doi:10.1038 / nbt0702-735. PMID 12089561.

[4] Masters JR (prosinec 2000). "Lidské rakovinové buněčné linie: skutečnost a fantazie". Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (3): 233–6. doi:10.1038/35043102. PMID 11252900.

[5] Engelhardt JF (srpen 2006). "AAV zasáhne genomické středové oko". Nat. Biotechnol. 24 (8): 949–50. doi:10.1038 / nbt0806-949. PMID 16900138.

[Urnov2010-6] A ^b Urnov, Fyodor D .; Rebar, Edward J .; Holmes, Michael C .; Zhang, H. Steve; Gregory, Philip D. (2010). "Úpravy genomu s vytvořenými nukleázami zinkových prstů". Genetika hodnocení přírody. 11 (9): 636–646. doi:10.1038 / nrg2842. PMID 20717154.

[7] Radecke S, Radecke F, Cathomen T, Schwarz K (duben 2010). „Oprava genu nukleázou indukovanou zinkovým prstem pomocí oligodeoxynukleotidů: požadované a nežádoucí úpravy cílového lokusu“. Mol. Ther. 18 (4): 743–53. doi:10,1038 / mt.2009,304. PMC 2862519. PMID 20068556.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]