Vectorette PCR - Vectorette PCR

Tento článek je o Vectorette PCR. Pro PCR viz Polymerázová řetězová reakce. Pro další použití viz PCR (disambiguation).
Kroky v PCR

Vectorette PCR je variace polymerázová řetězová reakce (PCR) navržený v roce 1988.[1] The polymerázová řetězová reakce (PCR) byla vytvořena a také patentována během 80. let.[2] Vectorette PCR byl poprvé zaznamenán a popsán v článku v roce 1990 Rileyem a jeho týmem.[3] Od té doby několik varianty PCR byly vytvořeny. Vectorette PCR se zaměřuje na amplifikaci specifické sekvence získané z vnitřní sekvence, která je původně známá až do konce fragmentu.[4] Několik výzkumů tuto metodu využilo jako příležitost k provádění experimentů s cílem odhalit potenciální využití, která lze odvodit z Vectorette PCR.[1]

Úvod

Vectorette PCR je podobná PCR s tím rozdílem, že je schopná získat sekvenci požadovanou pro amplifikaci z již známého místa primeru.[5] Zatímco PCR potřebuje informace o již známých sekvencích na obou koncích, Vectorette PCR vyžaduje pouze předchozí znalost jednoho.[1] To znamená, že je schopen aplikovat metodu PCR, která potřebuje informace o sekvenci z obou konců na fragmenty DNA které obsahují informace o sekvenci pouze na jednom konci a nikoli na druhém.[6][7] K dosažení tohoto cíle musí nejprve projít touto metodou konkrétní kroky. Tyto kroky byly prozkoumány za účelem objevení vědeckého využití Vectorette PCR a způsobu jejich použití.[1]

Kroky

Vectorette PCR může vyvinout strategii k jednosměrné amplifikaci PCR.[8] Vectorette PCR zahrnuje tři hlavní kroky.[1] První krok zahrnuje využití a restrikční enzym za účelem digesce vzorku DNA.[1][6] DNA, která má být použita pro účely vyšetřování, musí být schopna být štěpena restrikčními enzymy, které jsou vhodné pro daný gen, jinak nelze vytvořit fragmenty DNA, které tvoří obecnou populaci.[9] Poté je knihovna Vectorette spojena ligací jednotek Vectorette do příslušných Fragmenty DNA které byly dříve tráveny.[1][6] Ligace je akt spojování dvou věcí dohromady.[10] Jednotka Vectorette je pouze částečně ne zcela dvouvláknová s neodpovídající částí umístěnou ve středu jednotky.[11] Neshoduje se proto, aby jí pomohla vyhnout se pokusům primerů Vectorette přimět ji k syntéze prvního řetězce. Tím se také zabrání jakémukoli nespecifickému primování.[11] Tato ligace spojuje vektoretu, která je dvouvláknová, a konce restrikčních fragmentů, které byly dříve vytvořeny v prvním kroku.[12] Tímto způsobem se zavede známá sekvence, která se používá k aktivaci PCR reakce na jedné straně, zatímco druhá se aktivuje na genomové sekvenci, která je již uživateli známa.[12] Třetí a poslední krok má dvě části. To je způsobeno tím, že existují dva primery, iniciační primer (IP) a Vectorette primer (VP), které působí v různých fázích. Během první části pracuje IP na zesílení prodloužení primeru, zatímco VP zůstává hybridizován s produktem; v této fázi se tedy neprovádí žádné zesílení pozadí. To se však během poslední a následující části PCR mění, protože priming, který se provádí, pochází jak z IP, tak z VP.[6]

Výzkum

Mnoho výzkumů bylo provedeno na Vectorette PCR a aplikacích, které má v oblasti biologie. Vědci použili Vectorette PCR k odebrání transgen obklopující DNA a izolovat ji. Tuto techniku ​​použili na DNA patřící myším, která byla vedle transgenních řezů. Z toho byli vědci schopni ukázat, že použití Vectorette je schopné usnadnit obnovu a mapování sekvencí v komplexu genomy. Zjistili také, že Vectorette PCR může pomoci při analýze sekvencí subvektorováním, když jsou předmětem po ruce produkty PCR velké velikosti.[5]

Další práce se zabývaly vývojem metody využívající Vectorette PCR k dosažení genomové chůze. Pomocí Vectorette PCR byli vědci schopni získat jednořetězcovou DNA získanou z produktů PCR za účelem jejich sekvenování. Z toho byl identifikován přístup, ve kterém byla možná amplifikace sekvencí, které byly dříve necharakterizované. Tento výzkum ukazuje, jak lze rychle vyvinout nové sekvence, když se ke spuštění použije pouze známá sekvence DNA.[6]

Další výzkum experimentoval s vytvořením metody, která postupuje v izolaci opakování mikrosatelitů. Použitím Vectorette PCR našli vědci rychlou techniku, jak toho dosáhnout pomocí nových mikrosatelitních opakování. Pokusili se a uspěli při použití této techniky k izolaci množství šesti mikrosatelitních opakování.[13]

Vectorette PCR se také používá nejen k identifikaci genomových pozic inzertních sekvencí (IS), ale také k jejich mapování. Výzkum v této oblasti osvětlil způsob, jak dokončit typizaci mikrobiálních skvrn a identifikaci a mapování věcí, jako jsou inzertní místa IS, která se nacházejí v mikrobiálních genomech. Technologie Vectorette PCR se osvědčí, pokud jde o rychlý a jednoduchý průzkum prvků IS genomů.[14]

Transponovatelný prvek „Transposon“ nebo „TE“ je variace genetických prvků, která je schopná změnit své umístění v genomu procesem zvaným „skákání“.[15] Displej TE je navržen tak, aby představoval různé variace míst pro vkládání TE, což pomáhá vytvářet četné dominantní značky.[16] Problémem, který vznikl v původní metodě, bylo nalezení metody PCR, která by mohla být specifická a účinná při výstupu z transpozonu v genomu.[16] Vědci našli řešení tohoto problému pomocí metody Vectorette PCR jako metody PCR. Protože Vectorette PCR je schopná být specifická svou izolací a amplifikací genů, pomohlo to při jejich výzkumu a pomohlo to zlepšit metodu zobrazení TE ušetřením času i nákladů.[16] Vědci pak byli schopni vyrobit řadu dominantních markerů pomocí Vectorette PCR, která je založena na neradioaktivním TE displeji.[16]

Lymfom štítné žlázy je nemoc, která vede k transformaci lymfocyty patřící do štítné žlázy do buněk rakovinné povahy.[17] Vědci testovali novou metodu, která pomáhá při diagnostice tohoto stavu. Použití Vectorette PCR bylo kombinováno s trávením restrikčními enzymy a bylo zjištěno, že Vectorette PCR se ukázala být užitečná při jejich studiu a pomáhala při diagnostice lymfomu štítné žlázy.[18]

Vědci zkoumali potenciální využití Vectorette PCR při vyšetřování genů chorob. Vzali dvě metody, trinukleotid se opakuje které se konkrétně používají k cílení na transkribované oblasti a Vectorette PCR jednoduché opakování sekvence nebo SSR.[19] Předpokládá se, že z těchto SSR mohou být vyrobeny genetické markery. Výsledek tohoto výzkumu by měl pomoci vědcům pokusit se o odvození genetických markerů, které jsou přenosné z neznámých genomů. K odhalení SSR, které lemují trinukleotidovou repetici, která byla cílena pro testování, byla použita Vectorette PCR.[19] Toto je také známé jako TNR nebo trinukleotidová Vectorette PCR. Věří, že lze použít jejich metodu TNR v kombinaci s amplifikací poskytnutou Vectorette PCR eukaryoty vytvořit molekulární markery které jsou založeny na jednoduchých sekvencích opakování. Vědci si také myslí, že tato metoda bude mít hodnotu při pokusu o izolaci genů, které jsou schopné vyvolat nemoci.[19]

Použití

Použití, která byla odvozena z Vectorette PCR, je mnoho a byla užitečná pro vědu biologie. Například vede k metodám, které mohou pomoci při propuknutí nemocí usnadněním podtypu patogeny které jsou podobné nebo úzce související.[14] Lze jej také použít k diagnostice určitých onemocnění.[18] Dříve na této stránce bylo poznamenáno, že Vectorette PCR může vést k mnoha funkcím, které lze provádět na nových sekvencích DNA umístěných v blízkosti již známé sekvence. Tyto funkce, jako je izolace DNA, její amplifikace a analýza, stojí za využitím metody Vectorette PCR.[1] Tato použití jsou věci, jako je procházení genomu, sekvenování DNA pro konce kvasinkových umělých chromozomů (YAC) a kosmidové inzerty, schopnost mapovat introny a promotory v genomové DNA a regionech s mutacemi, což usnadňuje sekvenování klonů velké velikosti a vyplňování mezer, které vznikají během mapování genomů.[1]

An intron je sekvence DNA, která je ohraničena exony a proto se nachází mezi nimi.[20] Je to oblast, která je vyříznuta, zatímco jsou exony exprimovány, a tak introny neovlivňují kód aminokyselin. Genovou expresi může ovlivnit pouze řada intronových sekvencí.[20] Bylo zjištěno, že metoda Vectorette PCR je prospěšná, pokud jde o charakterizaci těchto intronových sekvencí, pokud se zjistí, že jsou vedle známých sekvencí.[21]

cDNA nebo komplementární DNA je sekvence DNA, která je komplementární s RNA, která je templátem při syntéze DNA během procesu reverzní transkriptázy.[22] Vectorette PCR, která využívá primery pocházející z cDNA, vede k metodě, která je schopná získat intronové sekvence, které jsou umístěny v sousedství exonů a napomáhají rozvoji struktury genů.[23] Je toho schopen dosáhnout při inicializaci procesu sekvencí cDNA a klonem genomu.[23]

Vectorette PCR také dává uživateli výhodu, než kdyby používal jiné existující technologie. Uživatel bude schopen provádět úkoly, jako je bezbuněčná genová manipulace, Vectorette PCR s minimem materiálu pro začátek a provádění Vectorette PCR s DNA, která nemusí být vysoce čistá. Tyto výhody umožňují uživateli ušetřit čas a zdroje a zároveň zvýšit rozsah DNA, na kterou lze cílit.[1]

Chromozomová chůze

Chromozomální chůze lze použít pro účely klonování gen.[24] Dělá to pomocí známých genových markerů, které jsou nejblíže, a proto je lze použít v technikách, jako je izolace sekvencí DNA a pomoc při sekvenování a klonování DNA organismů. Chromozomová chůze je také užitečná, pokud jde o vyplnění mezer, které mohou být přítomny v genomech, lokalizací klonů, které se překrývají s koncem klonu knihovny. To znamená, že pro procházení chromozomů je nutná klonová knihovna genomového formátu. To je důvod, proč je Vectorette PCR jednou z metod, kterou lze použít k vytvoření této knihovny pro procházení chromozomů. Vectorette PCR se hodí, když je nutné získat oblasti, které jsou jak proti směru, tak i proti směru toku a lemují již známou sekvenci. Získáním těchto regionů poskytuje knihovnu genomového formátu, který vyžaduje chůze chromozomů.[Citace je zapotřebí ]

Umělý chromozom kvasinek

Kvasinkový umělý chromozom nebo YAC je molekula DNA, která je vyvinuta lidmi, aby zachytila ​​sekvence DNA, které patří kvasinkovým buňkám, a klonovala je.[25] Kvasinkové umělé chromozomy lze vložit s fragmenty DNA ze sledovaného organismu. Buňky kvasinek pak asimilují umělý chromozom kvasinek, který obsahuje DNA ze sledovaného organismu.[25] The droždí buňky se poté množí v počtu a to vede k amplifikaci DNA, která do ní byla začleněna a která je poté izolována za účelem věcí, jako je sekvenování a mapování požadované DNA, tj. DNA původně vložené do umělého chromozomu kvasinek.[25] Vectorette PCR pomáhá s tímto procesem tím, že zajišťuje nejen izolaci konců umělých chromozomů kvasinek, ale také jejich zesílení.[26]

Reference

  1. ^ A b C d E F G h i j „Návod k obsluze systému Vectorette System Gene Walking“ (PDF). 2019.
  2. ^ „Polymerase Chain Reaction (PCR)“. www.ncbi.nlm.nih.gov. Citováno 2019-05-11.
  3. ^ Riley J, Butler R, Ogilvie D, Finniear R, Jenner D, Powell S, Anand R, Smith JC, Markham AF (květen 1990). „Nová, rychlá metoda pro izolaci koncových sekvencí z klonů umělých chromozomů kvasinek (YAC)“. Výzkum nukleových kyselin. 18 (10): 2887–90. doi:10.1093 / nar / 18.10.2887. PMC  330815. PMID  2161516.
  4. ^ "vektorová PCR - Terminologie molekulární biologie pro vektorovou PCR - GenScript". www.genscript.com. Citováno 2019-05-11.
  5. ^ A b Allen MJ, Collick A, Jeffreys AJ (říjen 1994). "Použití vektorové a subvektorové PCR k izolaci DNA obklopující transgen". Metody a aplikace PCR. 4 (2): 71–5. doi:10,1101 / gr. 4.2.71. PMID  7580887.
  6. ^ A b C d E Arnold C, Hodgson IJ (srpen 1991). „Vectorette PCR: nový přístup ke genomové chůzi“. Metody a aplikace PCR. 1 (1): 39–42. doi:10,1101 / gr. 1.1.39. PMID  1842919.
  7. ^ „Úvod do systému Vectorette“ (PDF). Citováno 11. května 2019.
  8. ^ McPherson, M. J. (2000). PCR. Møller, S. G. Oxford: BIOS. str. 235. ISBN  978-0585425306. OCLC  50760423.
  9. ^ Klonovací protokoly PCR. Chen, Bing-Yuan., Janes, Harry W. (2. vydání). Totowa, N.J .: Humana Press. 2002. str.278. ISBN  0585403341. OCLC  50175114.CS1 maint: ostatní (odkaz)
  10. ^ „Definice LIGACE“. www.merriam-webster.com. Citováno 2019-05-12.
  11. ^ A b Klonovací protokoly PCR. Chen, Bing-Yuan., Janes, Harry W. (2. vydání). Totowa, N.J .: Humana Press. 2002. str.276. ISBN  0585403341. OCLC  50175114.CS1 maint: ostatní (odkaz)
  12. ^ A b Cammack R, Atwood T, Campbell P, Parish H, Smith A, Vella F, Stirling J, eds. (01.01.2006). Oxfordský slovník biochemie a molekulární biologie (2. vyd.). Oxford University Press. doi:10.1093 / acref / 9780198529170.001.0001. ISBN  9780198529170.
  13. ^ Lench NJ, Norris A, Bailey A, Booth A, Markham AF (červen 1996). "Vectorette PCR izolace mikrosatelitních opakovacích sekvencí pomocí ukotvených dinukleotidových opakovacích primerů". Výzkum nukleových kyselin. 24 (11): 2190–1. doi:10.1093 / nar / 24.11.2190. PMC  145905. PMID  8668553.
  14. ^ A b Zhong S, děkan AM (červenec 2004). "Rychlá identifikace a mapování inzertních sekvencí v genomech Escherichia coli pomocí vektorové PCR". Mikrobiologie BMC. 4: 26. doi:10.1186/1471-2180-4-26. PMC  481064. PMID  15242519.
  15. ^ "Transposon | genetika". Encyklopedie Britannica. Citováno 2019-05-31.
  16. ^ A b C d Wang, Jianjun; Miller, Thomas A .; Park, Yoonseong (2006). "Vývoj více dominantních markerů pomocí neradioaktivního zobrazení transpozičních prvků založených na Vectorette PCR". Poznámky k molekulární ekologii. 6 (3): 642–645. doi:10.1111 / j.1471-8286.2006.01403.x. ISSN  1471-8286.
  17. ^ "Lymfom štítné žlázy | chirurgické oddělení Kolumbijské univerzity". columbiasurgery.org. Citováno 2019-05-17.
  18. ^ A b Takano T, Asahi S, Matsuzuka F, Hidaka Y, Yoshida H, Miyauchi A (leden 2008). „Aspirační biopsie - diagnostika nukleových kyselin u maligního lymfomu štítné žlázy metodou Vectorette PCR: zkušenost s osmi případy“. Výzkum leukémie. 32 (1): 151–4. doi:10.1016 / j.leukres.2007.03.019. PMID  17442390.
  19. ^ A b C Hilario, Elena; Fraser, Lena G .; McNeilage, Mark (10.03.2009). "Trinukleotid se opakuje jako návnada pro Vectorette PCR: nástroj pro vývoj markerů genetického mapování". Molekulární biotechnologie. 42 (3): 320–326. doi:10.1007 / s12033-009-9157-9. ISSN  1073-6085. PMID  19277911.
  20. ^ A b „Definice intronu - NCI Dictionary of Cancer Terms“. Národní onkologický institut. 2012-07-20. Citováno 2019-05-31.
  21. ^ Rubie, C .; Schulze-Bahr, E .; Wedekind, H .; Borggrefe, M .; Haverkamp, ​​W .; Breithardt, G. (září 1999). „Multistep-Touchdown Vectorette-PCR — a Rapid Technique for the Identification of IVS in Genes“. Biotechniky. 27 (3): 414–418. doi:10,2144 / 99273bm03. ISSN  0736-6205. PMID  10489595.
  22. ^ „Definice CDNA“. www.merriam-webster.com. Citováno 2019-05-31.
  23. ^ A b Roberts, Roland G .; Coffey, Alison J .; Bobrow, Martin; Bentley, David R. (srpen 1992). "Stanovení exonové struktury distální části genu pro dystrofin pomocí vektorové PCR". Genomika. 13 (4): 942–950. doi:10.1016 / 0888-7543 (92) 90005-D. PMID  1505985.
  24. ^ „Chromozomová chůze“. Definovaný termín - Slovník definovaných termínů pro právnické profese. Citováno 2019-05-31.
  25. ^ A b C „Kvasnicový umělý chromozom (YAC)“. Genome.gov. Citováno 2019-05-31.
  26. ^ Kleyn PW, Wang CH, Lien LL, Vitale E, Pan J, Ross BM, Grunn A, Palmer DA, Warburton D, Brzustowicz LM (červenec 1993). „Konstrukce kvasinkové umělé chromozomální oblasti zahrnující oblast genu pro oblast spinální svalové atrofie“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 90 (14): 6801–5. Bibcode:1993PNAS ... 90,6801K. doi:10.1073 / pnas.90.14.6801. PMC  47020. PMID  8341701.