Dvoufotonová excitační mikroskopie - Two-photon excitation microscopy

Nesmí být zaměňována s Zobrazovací mikroskopie druhé harmonické.
Dvoufotonová excitační mikroskopie myši střevo. Červené: aktin. Zelená: buněčná jádra. Modrá: hlen z pohárové buňky. Získá se při 780 nm za použití a Ti-safírový laser.

Dvoufotonová excitační mikroskopie (TPEF nebo 2PEF) je fluorescence zobrazovací technika, která umožňuje zobrazování živá tkáň až do tloušťky asi jednoho milimetru. Na rozdíl od tradičních fluorescenční mikroskopie, ve kterém je excitační vlnová délka kratší než emisní vlnová délka, dvoufotonová excitace vyžaduje současné buzení dvěma fotony s delší vlnovou délkou než emitované světlo. Dvoufotonová excitační mikroskopie obvykle používá blízko infračerveného (NIR) excitační světlo, které může také vzrušovat fluorescenční barviva. Pro každou excitaci jsou však absorbovány dva fotony světla NIR. Použití infračerveného světla minimalizuje rozptyl v tkáni. Kvůli absorpci více fotonů je signál pozadí silně potlačen. Oba účinky vedou ke zvýšení hloubka průniku pro tuto techniku. Dvoufotonová excitace může být lepší alternativou konfokální mikroskopie díky své hlubší penetraci do tkáně, efektivní detekci světla a snížené fotobělení.[1][2]

Dvoufotonový fluorescenční obraz (zelený) průřezu oddenek obarvené konvalinka. Vzrušení je na 840 nm a červená a modrá barva představují další kanály multiphotonových technik, které byly superponovány.

Pojem

Schematické znázornění energetických hladin (Jabłońského diagramy) fluorescenčního procesu, příklad fluorescenčního barviva, které emituje světlo při 460 nm. Jeden (fialový, 1PEF), dva (světle červený, 2PEF) nebo tři (tmavě červený, 3PEF) fotony jsou absorbovány, aby emitovaly foton fluorescence (tyrkysový).
Optická odezva z bodového zdroje. Zleva doprava: vypočítané distribuce intenzity xy (nahoře) a rz (dole) s logaritmickou stupnicí pro bodový zdroj zobrazovaný pomocí širokého pole (a), 2PEF (b) a konfokální mikroskopie (c). 2PEF a konfokální formy mají lepší poměr signálu k šumu než široké pole. Distribuce 2PEF je větší díky skutečnosti, že za distribuci intenzity odpovídá vlnová délka dvakrát delší než v případě širokého nebo konfokálního pole. Tato rozdělení intenzity jsou také známá jako funkce šíření bodů. Optické podmínky: vlnové délky excitace jsou 488 nm a 900 nm pro 1PEF a 2PEF; emisní vlnová délka je 520 nm; the numerická clona je 1,3 s objektiv pro ponoření do oleje.

Dvoufotonová excitace zaměstnává absorpce dvou fotonů, koncept, který poprvé popsal Maria Goeppert Mayer (1906–1972) ve své disertační práci v roce 1931,[3] a poprvé pozorováno v roce 1961 v CaF2: Eu2+ použití krystalu laser buzení Wolfgang Kaiser.[4] Isaac Abella předvedeno v roce 1962 v cesium pára, že je možná dvoufotonová excitace jednotlivých atomů.[5]

Dvoufotonová excitační fluorescenční mikroskopie má podobnosti s jinými technikami konfokální laserové mikroskopie, jako je laserové skenování konfokální mikroskopie a Ramanova mikroskopie. Tyto techniky používají ke generování obrázků zaostřené laserové paprsky skenované v rastrovém vzoru a obě mají optické krájení účinek. Na rozdíl od konfokálních mikroskopů neobsahují vícefotonové mikroskopy otvory pro dírkové otvory, které dávají konfokálním mikroskopům jejich optickou kvalitu krájení. Optický řez produkovaný multiphotonovými mikroskopy je výsledkem funkce rozložení bodů excitace: funkce šíření více fotonových bodů má obvykle tvar činky (delší v rovině x-y), ve srovnání se svislou funkcí šíření bodu ve tvaru ragbyové koule konfokálních mikroskopů. Koncept dvoufotonové excitace je založen na myšlence, že dva fotony se srovnatelně nižší energií fotonu, než je potřeba pro jednu fotonovou excitaci, mohou také excitovat fluorofor v jedné kvantové události. Každý foton nese přibližně polovinu energie potřebné k excitaci molekuly. Výsledkem buzení je následná emise fluorescenčního fotonu se stejným kvantový výnos to by bylo výsledkem konvenční absorpce jednoho fotonu. Vyzařovaný foton má obvykle vyšší energii (kratší vlnovou délku) než kterýkoli ze dvou vzrušujících fotonů. Pravděpodobnost téměř současné absorpce dvou fotonů je extrémně nízká. Proto vysoký vrchol tok typicky je zapotřebí excitačních fotonů, obvykle generovaných femtosekundou pulzní laser. Účelem použití dvoufotonového jevu je to, že axiální šíření funkce bodového šíření je podstatně nižší než u jednofotonové excitace. Výsledkem je, že je zlepšen rozsah podél rozměru z, což umožňuje řezání tenkých optických úseků. V mnoha zajímavých případech lze navíc tvar místa a jeho velikost navrhnout tak, aby splňovaly konkrétní požadované cíle.[6] Excitační lasery s více energiemi (obvykle infračervené) s delší energií (typicky infračervené) multipotonových mikroskopů jsou vhodné pro použití při zobrazování živých buněk, protože způsobují menší poškození než lasery s krátkou vlnovou délkou, které se obvykle používají pro buzení jedním fotonem, takže buňky lze pozorovat pro delší období s méně toxickými účinky.

Nejčastěji používané fluorofory mají excitační spektra v rozmezí 400–500 nm, zatímco laser používaný k excitaci dvoufotonové fluorescence leží v rozmezí ~ 700–1000 nm (infračervené) produkované Ti-safírové lasery. Pokud fluorofor absorbuje současně dva infračervené fotony, bude absorbovat dostatek energie, aby mohl být zvýšen do excitovaného stavu. Fluorofor pak bude emitovat jediný foton s vlnovou délkou, která závisí na typu použitého fluoroforu (obvykle ve viditelném spektru). Protože se během excitace fluoroforu absorbují dva fotony, pravděpodobnost fluorescenční emise z fluoroforů se kvadraticky zvyšuje s intenzitou excitace. Proto je mnohem více dvoufotonové fluorescence generováno tam, kde je laserový paprsek pevně zaostřen, než kde je více rozptýlený. Účinně je excitace omezena na malý ohniskový objem (~ 1 femtolitr), což má za následek vysoký stupeň odmítnutí neostrých objektů. Tento lokalizace buzení je ve srovnání s jednofotonový excitační mikroskopy, které potřebují k odmítnutí neostré fluorescence použít prvky, jako jsou dírky. Fluorescence ze vzorku je poté sbírána vysoce citlivým detektorem, jako je a fotonásobič trubka. Tato pozorovaná intenzita světla se stává jednou pixel v případném obrazu; ohnisko je skenováno skrz požadovanou oblast vzorku, aby se vytvořily všechny pixely obrazu.

Rozvoj

Schéma dvoufotonového mikroskopu.

Průkopníkem byla dvoufotonová mikroskopie a patentováno podle Winfried Denk a James Strickler v laboratoři Watt W. Webb na Cornell University v roce 1990. Spojili myšlenku absorpce dvou fotonů pomocí laserového skeneru.[7][8] Ve dvoufotonové excitační mikroskopii je infračervený laserový paprsek zaostřen objektivem. The Ti-safírový laser běžně používaný má šířku pulzu přibližně 100 femtosekund (fs) a opakovací frekvenci přibližně 80 MHz, což umožňuje vysokou hustotu fotonů a tok požadovaný pro absorpci dvou fotonů a je nastavitelný v širokém rozsahu vlnových délek. Režim uzamčen Yb-dopovaný vláknové lasery s 325 fs pulzy byly také použity pro kolagenové zobrazování, což ukazuje hloubku průniku nad 320 μm v kolagenu, což je podstatně lepší než hloubky 250 až 300 μm dosažitelné při spojení s konvenčním Ti-safírovým excitačním laserem.

Použití infračerveného světla k excitaci fluoroforů v rozptyl světla tkáň má další výhody.[9] Delší vlnové délky jsou rozptýleny v menší míře než kratší, což je výhodou pro zobrazování ve vysokém rozlišení. Navíc je méně pravděpodobné, že tyto fotony s nízkou energií způsobí poškození mimo ohniskový objem. Ve srovnání s konfokálním mikroskopem je detekce fotonů mnohem efektivnější, protože i rozptýlené fotony přispívají k použitelnému signálu. Tyto výhody pro zobrazování v rozptylujících tkáních byly rozpoznány až několik let po vynálezu dvoufotonové excitační mikroskopie.[10]

Existuje několik upozornění na použití dvoufotonové mikroskopie: Pulzní lasery potřebné pro excitaci dvou fotonů jsou mnohem dražší než lasery s kontinuální vlnou (CW) používané v konfokální mikroskopii. Dvoufotonové absorpční spektrum molekuly se může výrazně lišit od jejího jednofotonového protějšku. U velmi tenkých předmětů, jako jsou izolované buňky, mohou jednofotonové (konfokální) mikroskopy vytvářet obrázky s vyššími optické rozlišení kvůli jejich kratším excitačním vlnovým délkám. Naproti tomu v rozptylu tkáně mají vynikající optické schopnosti krájení a detekce světla dvoufotonového mikroskopu lepší výkon.

Aplikace

Hlavní

Dvoufotonová mikroskopie se zabývala mnoha oblastmi, včetně fyziologie, neurobiologie, embryologie a tkáňového inženýrství. Dokonce i tenké, téměř průhledné tkáně (například kožní buňky) byly díky této technice vizualizovány s jasnými detaily.[11] Vysokorychlostní zobrazovací schopnosti dvoufotonové mikroskopie mohou být také využity v neinvazivní optické biopsii.[12] V buněčné biologii se pro výrobu lokalizovaných chemických reakcí vhodně používá dvoufotonová mikroskopie.[je zapotřebí objasnění ][10] Pomocí dvoufotonové fluorescence a generace druhé harmonické –Na základě mikroskopie se ukázalo, že organické porfyrin - molekuly typu mohou mít různé přechodové dipólové momenty pro dvoufotonovou fluorescenci a generaci druhé harmonické,[13] o kterých se jinak předpokládá, že se vyskytují od stejného přechodového dipólového momentu.[14] Ukázalo se, že nedegenerativní dvoufotonová excitace nebo použití 2 fotonů o nestejných vlnových délkách zvyšuje fluorescenci všech testovaných malých molekul a fluorescenčních proteinů.[15]

Výzkum rakoviny

Ukázalo se také, že 2PEF je velmi cenný pro charakterizaci rakoviny kůže.[16]Bylo také prokázáno, že odhaluje zástavu nádorových buněk, interakci nádorových buněk s destičkami, interakci nádorových buněk s leukocyty a procesy metastatické kolonizace.[17]

Neurovědy

2PEF a 3PEF se používají k charakterizaci intaktní nervové tkáně.[18]

Zobrazování mozku in-vivo

Vícefotonová fluorescence (2PEF a 3PEF) je užitečným prostředkem pro zobrazování mozku in-vivo.[19]

Vybuzení vyššího řádu

Je také možná simultánní absorpce tří nebo více fotonů, což umožňuje mikroskopii s vyšší fotonovou excitací.[20] Takzvaná „mikroskopie excitované fluorescence tří fotonů“ (3PEF) je nejpoužívanější technikou po 2PEF, ke které je komplementární.

Hlavní článek: Tří fotonová mikroskopie

Barviva a fluorescenční proteiny pro dvoufotonovou excitační mikroskopii

Obecně platí, že všechny běžně používané fluorescenční proteiny (CFP, GFP, YFP, RFP) a barviva mohou být excitována v režimu dvou fotonů. Dvoufotonová excitační spektra jsou často podstatně širší, takže je obtížnější selektivně excitovat fluorofory přepínáním vlnových délek excitace. Existuje několik online databází dvoufotonových spekter dostupných na Cornell University[1] a Národní institut chemické fyziky a biofyziky v Estonsku.[21]

Bylo popsáno několik zelených, červených a NIR emitujících barviv (sondy a reaktivní značky) s extrémně vysokými průřezy absorpce 2 fotonů.[22] Vzhledem ke struktuře typu dárce-příjemce-dárce squaraine barviva jako Seta-670, Seta-700 a Seta-660 vykazují velmi vysokou účinnost absorpce 2 fotonů (2PA) ve srovnání s jinými barvivy,[22][23][24] SeTau-647 a SeTau-665, nový typ čtvercerotaxan, vykazují extrémně vysoké dvoufotonové akční průřezy až 10 000 GM v blízké IR oblasti, nepřekonané žádnou jinou třídou organických barviv.[22]

Viz také

Zdroje

  • Schmitt, Michael; Mayerhöfer, Thomas; Popp, Jürgen; Kleppe, Ingo; Weisshart, Klaus (2013). „Interakce světla a hmoty“. Příručka biofotoniky. doi:10.1002 / 9783527643981.bphot003. ISBN  9783527643981.
  • König, Karsten (2018). Multiphotonová mikroskopie a fluorescenční celoživotní zobrazování - aplikace v biologii a medicíně. De Gruyter. ISBN  978-3-11-042998-5.
  • Keikhosravi, Adib; Bredfeldt, Jeremy S .; Sagar, Abdul Kader; Eliceiri, Kevin W. (2014). „Zobrazování rakoviny druhé harmonické generace“. Kvantitativní zobrazování v buněčné biologii. Metody v buněčné biologii. 123. 531–546. doi:10.1016 / B978-0-12-420138-5.00028-8. ISBN  9780124201385. PMID  24974046.
  • Hanry Yu; Nur Aida Abdul Rahim (2020). Zobrazování v buněčném a tkáňovém inženýrství, 1. vydání. CRC Taylor & Francis. ISBN  9780367445867.

Reference

  1. ^ Denk W .; Strickler J .; Webb W. (1990). „Dvoufotonová laserová skenovací fluorescenční mikroskopie“. Věda. 248 (4951): 73–6. Bibcode:1990Sci ... 248 ... 73D. doi:10.1126 / science.2321027. PMID  2321027. S2CID  18431535.
  2. ^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). „Kapitola 19 Nelineární optika“. Fluorescenční mikroskopie v biologických vědách. Vydavatelé Bentham Science. 642–686. ISBN  978-1-68108-519-7. Citováno 24. prosince 2017.
  3. ^ Goeppert-Mayer M. (1931). „Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen“. Annals of Physics. 9 (3): 273–95. Bibcode:1931AnP ... 401..273G. doi:10.1002 / a 19314010303.
  4. ^ Kaiser, W .; Garrett, C. (září 1961). „Dvoufotonová excitace v CaF2: Eu2+". Dopisy o fyzické kontrole. 7 (6): 229–231. Bibcode:1961PhRvL ... 7..229K. doi:10.1103 / PhysRevLett.7.229.
  5. ^ Abella, I. D. (prosinec 1962). "Optická absorpce dvojitých fotonů v parách cesia". Dopisy o fyzické kontrole. 9 (11): 453–455. Bibcode:1962PhRvL ... 9..453A. doi:10.1103 / PhysRevLett.9.453.
  6. ^ Kaminer, Ido; Nemirovský Jonathan; Segev Mordechai (2013). "Optimalizace 3D multiphotonové fluorescenční mikroskopie". Optická písmena. 38 (19): 3945–3948. Bibcode:2013OptL ... 38,3945K. doi:10,1364 / OL.38.003945. PMID  24081095.
  7. ^ Denk W .; Strickler J.H .; Webb W.W. (1990). „Dvoufotonová laserová skenovací fluorescenční mikroskopie“. Věda. 248 (4951): 73–76. Bibcode:1990Sci ... 248 ... 73D. doi:10.1126 / science.2321027. PMID  2321027. S2CID  18431535.
  8. ^ USA 5034613  „Dvoufotonová laserová mikroskopie.“
  9. ^ Helmchen F .; Denk W. (2005). "Hluboká tkáňová dvoufotonová mikroskopie". Nat metody. 2 (12): 932–40. doi:10.1038 / nmeth818. PMID  16299478. S2CID  3339971.
  10. ^ A b Denk W .; Delaney K. (1994). "Anatomické a funkční zobrazování neuronů pomocí 2-fotonové laserové skenovací mikroskopie". J Neurosciho metody. 54 (2): 151–62. doi:10.1016/0165-0270(94)90189-9. PMID  7869748. S2CID  3772937.
  11. ^ Masters BR .; Takže PTC; Gratton E. (1997). "Multiphotonová excitační fluorescenční mikroskopie a spektroskopie lidské kůže in vivo". Biofyzikální deník. 72 (6): 2405–2412. Bibcode:1997BpJ .... 72,2405 mil. doi:10.1016 / s0006-3495 (97) 78886-6. PMC  1184440. PMID  9168018.
  12. ^ Bewersdorf J, Rainer P, Hell SW (1998). "Multifokální multiphotonová mikroskopie". Optická písmena. 23 (9): 665–667. Bibcode:1998OptL ... 23..655B. doi:10,1364 / ol.23,000655. PMID  18087301. S2CID  17549598.
  13. ^ Khadria A, Coene Y, Gawel P, Roche C, Clays K, Anderson HL (2017). „Push-pull pyropheoforbidy pro nelineární optické zobrazování“. Organická a biomolekulární chemie. 15 (4): 947–956. doi:10.1039 / C6OB02319C. PMID  28054076.
  14. ^ Reeve JE, Corbett AD, Boczarow I, Wilson T, Bayley H, Anderson HL (2012). „Zkoumání orientační distribuce barviv v membránách pomocí multiphotonové mikroskopie“. Biofyzikální deník. 103 (5): 907–917. Bibcode:2012BpJ ... 103..907R. doi:10.1016 / j.bpj.2012.08.003. PMC  3433607. PMID  23009840.
  15. ^ Sadegh, Sanaz; Yang, Mu-Han; Ferri, Christopher G. L .; Thunemann, Martin; Saisan, Payam A .; Wei, Zhe; Rodriguez, Erik A .; Adams, Stephen R .; Kiliç, Kivilcim; Boas, David A .; Sakadžić, Sava; Devor, Anna; Fainman, Yeshaiahu (18. září 2019). „Efektivní nedegenerovaná dvoufotonová excitace pro fluorescenční mikroskopii“. Optika Express. 27 (20): 28022–28035. Bibcode:2019Expr..2728022S. doi:10.1364 / OE.27.028022. PMC  6825618. PMID  31684560.
  16. ^ Paoli, John; Smedh, Maria; Ericson, Marica B. (září 2009). „Multiphotonová laserová skenovací mikroskopie - nová diagnostická metoda pro povrchové rakoviny kůže“. Semináře v kožní medicíně a chirurgii. 28 (3): 190–195. doi:10.1016 / j.sder.2009.06.007. PMID  19782943.
  17. ^ Tanaka, Koji; Toiyama, Yuji; Okugawa, Yoshinaga; Okigami, Masato; Inoue, Yasuhiro; Uchida, Keiichi; Araki, Toshimitsu; Mohri, Yasuhiko; Mizoguchi, Akira; Kusunoki, Masato (15. května 2014). „In vivo optické zobrazování metastáz rakoviny pomocí multiphotonové mikroskopie: krátký přehled“. American Journal of Translational Research. 6 (3): 179–187. PMC  4058302. PMID  24936213.
  18. ^ Svoboda, Karel; Yasuda, Ryohei (červen 2006). "Principy dvoufotonové excitační mikroskopie a její aplikace v neurovědě". Neuron. 50 (6): 823–839. doi:10.1016 / j.neuron.2006.05.019. PMID  16772166. S2CID  7278880.
  19. ^ Horton, Nicholas G .; Wang, Ke; Kobat, Demirhan; Clark, Catharine G .; Wise, Frank W .; Schaffer, Chris B .; Xu, Chris (2013). „In vivo třífotonová mikroskopie subkortikálních struktur v intaktním myším mozku“. Fotonika přírody. 7 (3): 205–209. Bibcode:2013NaPho ... 7..205H. doi:10.1038 / nphoton.2012.336. ISSN  1749-4885. PMC  3864872. PMID  24353743.
  20. ^ Xu, C; Zipfel, W; Shear, J B; Williams, RM; Webb, W W (1. října 1996). „Multiphotonová fluorescenční excitace: nová spektrální okna pro biologickou nelineární mikroskopii“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 93 (20): 10763–10768. Bibcode:1996PNAS ... 9310763X. doi:10.1073 / pnas.93.20.10763. PMC  38229. PMID  8855254.
  21. ^ "Spektra absorpce dvou fotonů | KBFI KBFI". KBFI. Citováno 2020-09-03.
  22. ^ A b C Podgorski K .; Terpetschnig E .; Klochko O.P .; Obukhova O.M .; Haas K. (2012). „Ultra jasné a stabilní červené a téměř infračervené fluorofory Squaraine pro dvoufotonové zobrazování in Vivo“. PLOS ONE. 7 (12): e51980. Bibcode:2012PLoSO ... 751980P. doi:10.1371 / journal.pone.0051980. PMC  3522634. PMID  23251670.
  23. ^ Liu, Lingzhi; Shao, Mei; Dong, Xiaohu; Yu, Xuefeng; Liu, Zhihong; On, Zhike; Wang, Ququan (15. října 2008). „Homogenní imunoanalýza založená na přenosu dvoufotonové excitační fluorescenční rezonanční energie“. Analytická chemie. 80 (20): 7735–7741. doi:10.1021 / ac801106w. PMID  18800850.
  24. ^ Pržonská, Olga V .; Webster, Scott; Padilha, Lazaro A .; Hu, Honghua; Kachkovski, Alexey D .; Hagan, David J .; Van Stryland, Eric W. (2010). „Dvoufotonová absorpce v molekulách konjugovaných s blízkým infračerveným zářením: Strategie návrhu a vztahy struktura – vlastnost“. Pokročilé fluorescenční reportéry v chemii a biologii I. Springerova řada o fluorescenci. 8. str. 105–147. doi:10.1007/978-3-642-04702-2_4. ISBN  978-3-642-04700-8.

externí odkazy