Fluorescenční mikroskop s vnitřním odrazem - Total internal reflection fluorescence microscope

(Cis-)fluorescenční mikroskop s vnitřním odrazem (TIRFM) diagram
  1. Vzorek
  2. Evanescentní vlnový rozsah
  3. Krycí sklíčko
  4. Ponorný olej
  5. Objektivní
  6. Emisní paprsek (signál)
  7. Budicí paprsek
Diagram (T-) celkového fluorescenčního mikroskopu (TIRFM)
  1. Objektivní
  2. Emisní paprsek (signál)
  3. Ponorný olej
  4. Krycí sklíčko
  5. Vzorek
  6. Evanescentní vlnový rozsah
  7. Budicí paprsek
  8. Křemenný hranol

A celková vnitřní reflexe fluorescenční mikroskop (TIRFM) je typ mikroskop se kterou může být tenká oblast vzorku, obvykle menší než 200 nanometrů pozorováno.

Pozadí

v buňka a molekulární biologie, velký počet molekulární události v buněčných površích, jako je buněčná adheze, vazba buněk pomocí hormony, vylučování z neurotransmitery a dynamika membrány byly studovány konvenčními metodami fluorescenční mikroskopy. Nicméně, fluorofory které jsou vázány na povrch vzorku a ty v okolním médiu existují v rovnováha Stát. Když jsou tyto molekuly excitovány a detekovány běžným fluorescenčním mikroskopem, výsledná fluorescence z těchto fluoroforů vázaných na povrch je často přemožena fluorescencí pozadí kvůli mnohem větší populaci nevázaných molekul. TIRFM umožňuje selektivní excitaci povrchově vázaných fluoroforů, zatímco nevázané molekuly nejsou excitovány a nefluoreskují. Vzhledem k sub-mikronové povrchové selektivitě se TIRFM stala metodou volby pro detekci jedné molekuly.

Přehled

Myšlenka využití úplného vnitřního odrazu k osvětlení buněk kontaktujících povrch skla byla poprvé popsána E.J. Ambrose v roce 1956.[1] Tuto myšlenku poté rozšířil Daniel Axelrod[2] na University of Michigan, Ann Arbor na začátku 80. let jako TIRFM. TIRFM používá postupná vlna selektivně osvětlovat a vzrušovat fluorofory v omezené oblasti vzorku bezprostředně sousedící s rozhraním sklo-voda. Evanescent elektromagnetické pole se exponenciálně rozpadá z rozhraní, a tak proniká do hloubky pouze přibližně 100 nm do vzorkového média. TIRFM tedy umožňuje selektivní vizualizaci povrchových oblastí, jako jsou bazální plazmatická membrána (které jsou asi 7,5 nm silné) buněk, jak je znázorněno na obrázku výše. Všimněte si však, že vizualizovaná oblast je široká alespoň několik stovek nanometrů, takže cytoplazmatická zóna bezprostředně pod plazmatickou membránou je nutně vizualizována navíc k plazmatické membráně během TIRF mikroskopie. Selektivní vizualizace plazmatické membrány vykresluje vlastnosti a události na plazmatické membráně v živých buňkách s vysokou osou rozlišení.

TIRF lze také použít ke sledování fluorescence jedné molekuly,[3][4] což z něj dělá důležitý nástroj biofyzika a kvantitativní biologie. Mikroskopie TIRF byla také použita při detekci DNA biomarkerů s jednou molekulou a diskriminaci SNP. [5]

Ukázalo se, že Cis-geometrie (TIRFM prostřednictvím cíle) a trans-geometrie (TIRFM založené na hranolu a světlovodu) poskytují různou kvalitu účinku celkové vnitřní reflexe. V případě trans-geometrie jsou excitační světelná dráha a emisní kanál oddělené, zatímco v případě objektivového typu TIRFM sdílejí objektiv a další optické prvky mikroskopu. Ukázalo se, že hranolová geometrie generuje čistou evanescentní vlnu, jejíž exponenciální rozpad se blíží teoreticky předpovídané funkci.[6] V případě objektivně založeného TIRFM je však evanescentní vlna kontaminována intenzivní rozptýlené světlo. Ukázalo se, že intenzita rozptýleného světla představuje 10-15% evanescentní vlny, což ztěžuje interpretaci dat získaných pomocí objektivního typu TIRFM [7][8]

Reference

  1. ^ Ambrose, EJ (24. listopadu 1956). "Povrchový kontaktní mikroskop pro studium buněčných pohybů". Příroda. 178 (4543): 1194. Bibcode:1956 Natur.178.1194A. doi:10.1038 / 1781194a0. PMID  13387666. S2CID  4290898.
  2. ^ Axelrod, D. (1. dubna 1981). „Kontakty buňka-substrát osvětlené celkovou vnitřní reflexní fluorescencí“. The Journal of Cell Biology. 89 (1): 141–145. doi:10.1083 / jcb.89.1.141. PMC  2111781. PMID  7014571.
  3. ^ Yanagida, Toshio; Sako, Yasushi; Minoghchi, Shigeru (10. února 2000). „Jednomolekulární zobrazování signalizace EGFR na povrchu živých buněk“. Přírodní buněčná biologie. 2 (3): 168–172. doi:10.1038/35004044. PMID  10707088. S2CID  25515586.
  4. ^ Andre a kol. Křížově korelovaný tirf / afm odhaluje asymetrické rozložení hlav generujících sílu podél samostatně sestavených syntetických myosinových vláken. BiophysicalJournal, 96: 1952–1960, 2009.
  5. ^ Sapkota, K .; et al. (2019). „Jednostupňová detekce Femtomoles DNA na základě FRET“. Senzory. 19 (16): 3495. doi:10,3390 / s19163495. PMID  31405068.
  6. ^ Ambrose, W; et al. (1999). "Detekce jedné molekuly s celkovou vnitřní excitací odrazu: porovnání signálu od pozadí a celkového signálu v různých geometriích". Cytometrie. 36 (3): 224–31. doi:10.1002 / (sici) 1097-0320 (19990701) 36: 3 <224 :: aid-cyto12> 3.0.co; 2-j. PMID  10404972.
  7. ^ Mattheyses A. a Axelrod, D. (2006). "Přímé měření profilu evanescentního pole vytvořeného objektivním TIRF." J Biomed Opt. 11: 014006A. doi:10.1117/1.2161018. PMID  16526883.
  8. ^ Brunstein M, Teremetz M, Hérault K, Tourain C, Oheim, M. (2014). „Odstranění nechtěné excitace vzdáleného pole v objektivu TIRF. Část I.“ Biophys. J. 106 (5): 1020. Bibcode:2014BpJ ... 106.1020B. doi:10.1016 / j.bpj.2013.12.049. PMC  4026778. PMID  24606927.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)

externí odkazy