Multiphotonová mikroskopie se širokým polem - Wide-field multiphoton microscopy - Wikipedia

Zobrazovací systém zobrazující multipotonový mikroskop s širokým polem^[1]

Multiphotonová mikroskopie se širokým polem^[2][3][4][5] odkazuje na optická nelineární zobrazovací technika na míru pro ultrarychlé zobrazování, při kterém je velká plocha objektu osvětlena a zobrazena bez nutnosti skenování. K vyvolání nelineárních optických procesů, jako jsou například, jsou zapotřebí vysoké intenzity dvoufotonová fluorescence nebo druhá harmonická generace. v skenování multiphotonových mikroskopů vysoké intenzity se dosáhne těsným zaostřením světla a obraz se získá skenováním paprskem. v širokoúhlé multiphotonové mikroskopie vysoké intenzity lze nejlépe dosáhnout pomocí opticky zesílen pulzním laserovým zdrojem k dosažení velkého zorného pole (~ 100 µm).^[2][3][4] Obraz je v tomto případě získán jako jediný snímek s CCD bez nutnosti skenování, což činí tuto techniku ​​zvláště užitečnou pro vizualizaci dynamických procesů současně napříč sledovaným objektem. U multiphotonové mikroskopie s širokým polem lze snímkovou frekvenci zvýšit až 1000krát ve srovnání s multiphotonová skenovací mikroskopie.^[3] Multiphotonové mikroskopy se širokým polem ještě nejsou komerčně dostupné, ale funkční prototypy existují v několika laboratořích optiky.

Úvod

Hlavní charakteristikou této techniky je osvětlení široké oblasti na vzorku pulzním laserovým paprskem. V nelineární optice je množství nelineárních fotonů (N) generovaných pulzním paprskem na (osvětlovací) plochu za sekundu úměrné^[6][7]

${ displaystyle N varpropto { frac {E ^ {2}} { tau A}} f}$,

kde E je energie paprsku v Joulech, τ je doba trvání pulzu v sekundách, A je svítící plocha v metrech čtverečních af je rychlost opakování pulzního paprsku v Hertzích. Zvětšení osvětlovací plochy tak snižuje množství generovaných nelineárních fotonů, pokud se nezvýší energie. Optické poškození závisí na hustotě energie, tj. Špičkové intenzitě na plochu I_str= E / (τA). Proto lze plochu i energii snadno zvýšit bez rizika optického poškození, pokud je udržována nízká intenzita píku na plochu, a přesto lze získat kvadratickou závislost na množství generovaných nelineárních fotonů. Například zvýšení plochy a energie 1000krát ponechá špičkovou intenzitu beze změny, ale zvýší generované nelineární fotony 1000krát. Těchto 1000 fotonů navíc je skutečně generováno na větší ploše. Při zobrazování to znamená, že dalších 1000 fotonů je rozloženo po celém obrazu, což se na první pohled nemusí zdát výhodou oproti multiphotonové skenovací mikroskopii. Výhoda se však projeví při zohlednění velikosti obrázku a doby skenování.^[3] Množství nelineárních fotonů na obrazový snímek za sekundu generovaných multiphotonovým mikroskopem se širokým polem ve srovnání se skenovacím multiphotonovým mikroskopem je dáno vztahem^[3]

${ displaystyle { frac {N _ { mathrm {wide-field}}} {N _ { mathrm {skenování}}}} = n { frac {f _ { mathrm {wide-field}}} {f _ { mathrm {skenování}}}}}$,

když předpokládáme, že v obou systémech je použita stejná špičková intenzita. Zde n je počet skenovacích bodů takový, že ${ textstyle A _ { mathrm {wide-field}} = nA _ { mathrm {skenování}}}$.

Omezení

• Tato technika není vhodná pro zobrazování hluboko v rozptylu tkáně (např. Mozku), protože kvalita obrazu se s rostoucí hloubkou rychle zhoršuje
• Mez, na kterou lze energii zvýšit, závisí na laserovém systému. Optické zesilovače jako a regenerační zesilovač, může obvykle přinést energii až mJ s nižší rychlostí opakování ve srovnání se systémy založenými na oscilátorech (např. Ti: safírový laser ).
• Možné poškození optiky, pokud je paprsek nějak zaostřen někde v optickém systému na malou oblast. Existují různé metody pro dosažení požadovaného osvětlení bez rizika poškození optiky (viz Metody).
• Hloubkový průřez může chybět.

Výhody

• Ultrarychlé zobrazování. K vytvoření jednoho snímku je zapotřebí jediný laserový snímek. Snímková frekvence je tedy omezena na opakovací frekvenci laserového systému nebo snímkovou frekvenci CCD kamery.
• Nižší poškození buněk. Ve vodných systémech (jako jsou buňky) umožňují střední až nízké opakovací frekvence (1 - 200 kHz) tepelnou difúzi mezi světelnými impulsy, takže prahová hodnota poškození je vyšší než u vysokých opakovacích rychlostí (80 MHz).^[8][9]
• Celý objekt lze pozorovat současně díky osvětlení širokého pole.
• Větší hloubka průniku v biologickém zobrazování ve srovnání s jednofotonovou fluorescencí v důsledku požadovaných delších vlnových délek.
• Vyšší rozlišení než jednofotonová fluorescenční mikroskopie s širokým polem. Optické rozlišení může být srovnatelné nebo lepší než vícefotonové skenovací mikroskopy [].

Metody

Existuje technická obtížnost dosáhnout velké osvětlovací oblasti bez poškození zobrazovací optiky. Jedním z přístupů je takzvané časoprostorové zaostřování^[4][5] ve kterém je pulzní paprsek prostorově rozptýlen difrakční mřížkou tvořící „duhový“ paprsek, který je následně zaostřen objektivem.^[5] Účinek zaostření „duhového“ paprsku při zobrazování difrakční mřížky nutí různé vlnové délky překrývat se v ohniskové rovině objektivu. Různé vlnové délky pak interferují pouze s překrývajícím se objemem, pokud není zaveden žádný další prostorový nebo časový rozptyl, takže je vyvoláno intenzivní pulzní osvětlení a je schopno poskytovat obrazy v průřezu. Axiální rozlišení je obvykle 2–3 µm^[4][5] dokonce is technikami strukturovaného osvětlení.^[10][11] Prostorová disperze generovaná difrakční mřížkou zajišťuje, že se energie v laseru šíří po širší ploše v objektivu objektivu, čímž se snižuje možnost poškození samotné čočky.

Na rozdíl od toho, co se původně myslelo, je časové zaostření pozoruhodně robustní k rozptylu^[12]. Byla použita schopnost pronikat zakaleným médiem s minimální skvrnou optogenetika, umožňující foto-excitaci libovolných světelných vzorců tkání^[12]. Časové zaostření bylo později kombinováno s detekcí jednoho pixelu, aby se překonal účinek rozptylu na fluorescenční fotony^[13]. Tato technika, tzv TRAFIX, umožnilo zobrazování širokého pole přes biologickou tkáň ve velkých hloubkách s vyšší poměr signálu k pozadí a nižší fotobělení než standardní bodové skenování dvoufotonová mikroskopie^[13].

Další jednodušší metoda se skládá ze dvou paprsků, které jsou volně zaostřeny a překrývají se na ploše (~ 100 µm) na vzorku.^[2][3] Pomocí této metody je možné mít přístup ke všem prvkům ${ displaystyle chi ^ {(2)}}$ tenzor díky schopnosti měnit polarizaci každého paprsku samostatně.

Reference