Funkční klonování - Functional cloning

Funkční klonování je molekulární klonování technika, která se spoléhá na předchozí znalost kódovaného protein Je sekvence nebo funkce pro gen identifikace.[1][2][3] V tomto testu, a genomický nebo cDNA knihovna je testován za účelem identifikace genetické sekvence sledovaného proteinu. Výraz cDNA knihovny mohou být skrínovány pomocí protilátky specifické pro sledovaný protein nebo se mohou spoléhat na selekci prostřednictvím funkce proteinu.[1] Historicky byla aminokyselinová sekvence proteinu použita k přípravě degenerovaných oligonukleotidů, které pak byly sondováno proti knihovně k identifikaci genu kódujícího požadovaný protein.[2][3] Jakmile jsou identifikovány kandidátské klony nesoucí požadovaný gen, jsou seřazeno a jejich totožnost je potvrzena. Tato metoda klonování umožňuje výzkumným pracovníkům sledovat celý genomy bez předchozí znalosti umístění genu nebo genetické sekvence.[1]
Tuto techniku lze použít k identifikaci genů, které kódují podobné proteiny z jednoho organismu do druhého.[4] Podobně lze tuto techniku spárovat s metagenomické knihovny k identifikaci nových genů a proteinů, které plní podobné funkce, jako je identifikace nových antibiotika skríninkem na beta-laktamáza aktivita nebo výběr pro růst za přítomnosti penicilin.[5]
Experimentální pracovní postup

Pracovní postup experimentu s funkčním klonováním se liší v závislosti na zdroji genetického materiálu, rozsahu předchozích znalostí o požadovaném proteinu nebo genu a schopnosti prověřovat funkci proteinu. Obecně se funkční klonovací experiment skládá ze čtyř kroků: 1) odběr vzorků, 2) příprava knihovny, 3) screening nebo selekce a 4) sekvenování.
Kolekce vzorků
Genetický materiál se shromažďuje z konkrétního typu buňky, organismu nebo vzorku prostředí, který je relevantní pro biologickou otázku. Ve funkčním klonování mRNA je běžně izolovaný a cDNA se připravuje z izolované mRNA (Extrakce RNA ).[6] Za určitých okolností genomová DNA mohou být izolovány, zvláště když jsou jako zdroj genetického materiálu použity vzorky prostředí.[1]
Příprava knihovny
Pokud je výchozí materiál genomová DNA, DNA je stříhána za vzniku fragmentů vhodné délky pro vektor volby. Na fragmenty DNA nebo cDNA se poté působí restrikční endonukleázy a ligován do a plazmid nebo chromozomální vektory. V případě testů, které provádějí screening na protein nebo jeho funkci, an expresní vektor se používá k zajištění exprese genového produktu. Volba vektoru bude záviset na původu DNA nebo cDNA, aby byla zajištěna správná exprese a bylo zajištěno, že kódovaný gen bude spadat do mezí velikosti inzertu vektoru.[7]
Výběr hostitele je důležitý, aby bylo zajištěno, že využití kodonů bude podobný dárcovskému organismu. Hostitel bude také muset zaručit, že správné posttranslační úpravy a skládání bílkovin dojde k umožnění správné funkce exprimovaných proteinů.[7]
Screening nebo výběr
Způsob screeningu připravených genomových nebo cDNA knihoven na požadovaný gen je vysoce variabilní v závislosti na experimentálním designu a biologické otázce. Jednou z metod screeningu je: sonda kolonie přes Southern blot s degenerovanými oligonukleotidy připravenými z aminokyselinové sekvence sledovaného proteinu.[8] V expresních knihovnách lze požadovaný protein identifikovat skríninkem s protilátkou specifickou pro dotazovaný protein pomocí Western blot k identifikaci kolonií nesoucích požadovaný gen. Za jiných okolností lze ke stanovení nebo výběru aktivity proteinu použít specifický test.[1] Například geny spojující odolnost proti antibiotikům lze vybrat zvětšením kolonií knihovny na médiu obsahujícím určenou antibiotikum.[5] Dalším příkladem je screening na enzymatická aktivita inkubací se substrátem, který je katalyzován na kolorimetrickou sloučeninu, kterou lze snadno vizualizovat.[9]
Sekvenování
Posledním krokem funkčního klonování je sekvence DNA nebo cDNA z klonů, které byly úspěšně identifikovány v kroku screeningu nebo výběru. Sekvence pak může být anotována a použita pro následné aplikace, jako například proteinová exprese a čištění pro průmyslové aplikace.[10]
Výhody
Mezi výhody funkčního klonování patří schopnost vyhledávat nové geny s požadovanými aplikacemi v organismech, které nelze kultivovat, zejména z bakteriálních nebo virových vzorků.[1] Kromě toho lze identifikovat geny kódující proteiny se souvisejícími funkcemi, pokud existuje nízká sekvenční podobnost kvůli schopnosti screenovat samotnou funkci proteinu. Funkční klonování umožňuje identifikaci genu bez předchozí znalosti sekvence genomu organismu nebo polohy genu v genomu.[1]
Omezení
Stejně jako u jiných klonovacích technik ovlivňuje výběr vektoru a hostitele úspěšnost identifikace genu prostřednictvím funkčního klonování kvůli zkreslení klonování. Vektor musí mít velikost inzertu, která pojme celou sekvenci DNA exprimovaného proteinu. Navíc v expresních vektorech promotéři a terminátory musí fungovat ve vybraném hostitelském organismu. Výběr hostitele může ovlivnit transkripce a překlad kvůli odlišování využití kodonů, transkripční a překladové stroje nebo posttranslační úpravy v hostiteli.[7][1]
Mezi další omezení patří pracovně náročná příprava knihovny a potenciální obrazovky, které mohou být nákladné i časově náročné.[7]
Alternativní přístupy
Poziční klonování

Poziční klonování je další technika molekulárního klonování pro identifikaci požadovaného genu. Tato metoda používá přesnou chromozomální polohu místo funkce k vedení identifikace genu.[11] Z tohoto důvodu se tato metoda zaměřuje na veškerý genetický materiál v chromozomu místo a nevytváří žádné předpoklady o funkci.[11] v modelové organismy jako myši nebo droždí, tato metoda se používá častěji, protože informace o poloze požadovaného genu lze získat z sekvenovaný genom. Tato metoda se však stává mnohem těžkopádnější, pokud nejsou k dispozici informace o sekvenci. V tomto případě, analýza vazby lze také použít.[11] Funkční klonování se na druhou stranu snadněji používá v organismech, jako je bakteriální patogeny to jsou životaschopný, ale nekulturní a kde nejsou k dispozici sekvenční data, ale stále je zajímavá genová homologie nebo funkce proteinu.[11]
Způsob, jak rozlišit mezi funkčním a pozičním klonováním, je vizualizovat geny jako slova. Funkční klonování je jako použití tezauru k vyhledání slov a výběru nových slov, která mají stejný význam (nebo funkce).[12] Poziční klonování se spíše podobá výběru konkrétní stránky slovníku a následnému procházení slov, která vás zajímají, pouze na této stránce.[12]
Výpočtově určit homologii
S příchodem sekvenování technologie stále levnější a levnější, je nyní proveditelnější sekvenovat neznámý genom a poté výpočetně určit homologie místo screeningu.[13] To přináší další výhodu, že je možné testovat více zajímavých genů současně a zkracuje dobu experimentu. Umožňuje také vyhnout se klonovacím postupům náročným na práci.[14] Pokud se však vydáte touto cestou, je třeba vzít v úvahu další předsudky a překážky. Pomocí sekvenovaných dat je možné provádět screening pouze na základě homologie.[1] Přístup založený na funkcích tak umožňuje objev nových enzymů, jejichž funkce by nebylo možné předpovědět pouze na základě sekvence DNA.[1] I když je tedy sekvenování experimentálně méně náročné na práci, může to také vést ke zmeškání požadovaných genů kvůli odlišné homologii sekvence v genech souvisejících funkcí.
Sestava Gibson
Sestava Gibson je metoda rychlého klonování, která využívá tři primární enzymy; 5 ' exonukleáza, polymeráza a ligáza.[15] Exonukleáza štěpí 5 'konec fragmentů DNA a zanechává 3' přesah.[15] Pokud je na každém konci inzertu DNA významná homologie (20–40 bp), může hybridizovat s doplňkovou páteří.[15] Poté může polymeráza vyplnit mezery, zatímco ligáza na konci spojí zářezy.[15] Tato metoda výrazně zvyšuje rychlost klonování a úspěšnost klonování do páteře vektoru.[15] Vyžaduje však, aby fragment DNA měl významnou homologii s plazmidem.[15] Z tohoto důvodu musí být předem známa znalost klonované sekvence. U funkčního klonování to není požadavek.
TOPO klonování
TOPO klonování je metoda klonování, která používá Taq polymeráza.[16] Je to proto, že Taq opouští singl adenosin přesah na 3 'konci PCR reakční produkty.[16] Využití těchto znalostí, páteř s 5 ’ tymin převis lze použít pro účely klonování.[16] V tomto případě musí být známa znalost klonovaného fragmentu, aby bylo možné pro něj vytvořit PCR primery, a počet TOPO klonovacích kompatibilních vektorů je relativně malý. Poskytuje však výhodu, že reakce trvá jen asi 5 minut.[16]
Klonování rekombinace brány
Klonování rekombinace brány je klonovací metoda, při které se fragment DNA přesouvá z jednoho hlavního řetězce plazmidu do druhého pomocí jediného homologní rekombinace událost.[17] Aby však tato metoda fungovala, musí být požadovaný fragment DNA ohraničen rekombinačními místy.[17] I když tato metoda není striktně alternativou, umožňuje pohyb DNA fragmentů z jednoho plazmidu do druhého rychleji než vytvoření zcela nové genomové knihovny. Důvodem, proč může být tato metoda použita ve spojení s funkčním klonováním, je umístění knihovny pod jiný promotor nebo na páteř s jiným selekčním markerem.[17] To se může hodit, pokud si jednotlivec chce vyzkoušet funkční klonování u široké škály bakterií a pokusit se s tímto problémem bojovat kodonové zkreslení.[17][7]
Aplikace
Stanovení homologie v prostředí
Metagenomika je jedno z největších polí, které běžně používá funkční klonování. Metagenomika studuje veškerý genetický materiál ze specifického vzorku prostředí, jako je střevní mikrobiom nebo voda v jezeře.[1] Funkční knihovny jsou vytvořeny, které obsahují fragmenty DNA z prostředí.[1] Protože původní bakterie, ze které pocházela sekvence DNA, nelze snadno detekovat, vytváření metagenomických funkčních knihoven má výhody. Méně než 1% všech bakterií se snadno pěstuje v laboratoři a zanechává velké procento bakterií, které nelze pěstovat.[18] Použitím funkčních knihoven lze stále studovat genové funkce nekulturních bakterií.[1] Kromě toho tyto nekultivované mikroby poskytují zdroj pro objev nových enzymů s biotechnologickými aplikacemi. Některé nové proteiny, které byly objeveny z mořského prostředí, zahrnují enzymy, jako jsou proteázy, amylázy, lipázy, chitinázy, deoxyribonukleázy a fosfatázy.[19]
Stanovení homologie u známého druhu
Existují situace, kdy je nezbytné určit, zda je genový homolog z jednoho zdroje přítomen v jiném organismu. Například identifikace románu DNA polymerázy pro polymerázová řetězová reakce (PCR) reakce, které syntetizují molekuly DNA z deoxyribonukleotidů.[20] Zatímco lidská polymeráza optimálně pracuje při 37 ° C (98,6 ° F), DNA nedenaturuje až do 94–98 ° C (201–208 ° F).[20] To představuje problém, protože při těchto teplotách by lidská DNA polymeráza denaturovala během kroku denaturace PCR reakce, což mělo za následek nefunkční polymerázový protein a neúspěšnou PCR. K boji proti tomu DNA polymeráza z a termofilní Mohou být použity bakterie, které rostou při vysokých teplotách. Příkladem je Taq polymeráza který pochází z termofilní bakterie Thermus aquaticus.[20] Dalo by se nastavit funkční klonovací síto pro nalezení homologních polymeráz, které mají další výhodu v tom, že jsou termostabilní při vysokých teplotách.
S ohledem na to je 3173 polymeráza, další polymerázový enzym, nyní běžně používaný v RT-PCR reakce byly objeveny pomocí výše uvedené teorie.[21] V RT-PCR reakcích se běžně používají dva oddělené enzymy. První je retrovir reverzní transkriptáza převést RNA na cDNA.[21] Druhým je termostabilní DNA polymeráza k amplifikaci cílové sekvence.[21] Polymeráza 3173 je schopna vykonávat obě enzymatické funkce, což vede k lepší možnosti pro RT-PCR.[21] Enzym byl objeven pomocí funkčního klonování z virového hostitele původně nalezeného v horkých pramenech Octopus (93 ° C) v Yellowstonském národním parku.[21]
Aplikace pro lidské zdraví
Jednou z přetrvávajících výzev při léčbě bakteriálních infekcí je odolnost proti antibiotikům který obvykle nastává, když pacienti úplně neléčí léky, a tudíž umožňují bakteriím, aby si v průběhu času vytvořili rezistenci na antibiotika.[22] Abychom pochopili, jak bojovat proti rezistenci na antibiotika, je důležité pochopit, jak se bakteriální genom vyvíjí a mění u zdravých jedinců, aniž by se v nedávné době používaly antibiotika jako základní linie.[22] Pomocí funkční techniky založené na klonování byla DNA izolována z člověka mikroflóra byly klonovány do expresních vektorů v Escherichia coli.[22] Poté byla antibiotika aplikována jako obrazovka.[22] Pokud plazmid obsahoval genovou vložku, která poskytovala rezistenci na antibiotika, buňka přežila a byla vybrána na destičce.[22] Pokud vložka neposkytla žádný odpor, buňka zemřela a nevytvořila kolonii.[22] Na základě výběru buněčných kolonií, které přežily, byl sestaven lepší obraz genetických faktorů přispívajících k rezistenci na antibiotika. Většina identifikovaných genů rezistence byla dříve neznámá.[22] Použitím techniky založené na funkčním klonování je možné objasnit geny vedoucí k rezistenci na antibiotika, abychom lépe porozuměli léčbě bakteriálních infekcí.
Viz také
Reference
- ^ A b C d E F G h i j k l m Lam, Kathy N .; Cheng, Jiujun; Engel, Katja; Neufeld, Josh D .; Charles, Trevor C. (2015). „Současné a budoucí zdroje pro funkční metagenomiku“. Hranice v mikrobiologii. 6: 1196. doi:10.3389 / fmicb.2015.01196. ISSN 1664-302X. PMC 4625089. PMID 26579102.
- ^ A b Oxfordský slovník biochemie a molekulární biologie. Cammack, Richard, Ph. D. (rev. Vyd.). Oxford: Oxford University Press. 2006. ISBN 9780198529170. OCLC 65467611.CS1 maint: ostatní (odkaz)
- ^ A b Schindler-Hoehn; Hoehn, Holger (01.01.2007). Fanconiho anémie: paradigmatická nemoc pro porozumění rakovině a stárnutí. Karger Medical and Scientific Publishers. ISBN 9783805582773.
- ^ Skjøt, M .; Kauppinen, S .; Kofod, L .; Fuglsang, C .; Pauly, M .; Dalbøge, H .; Andersen, L. (01.07.2001). "Funkční klonování endo-arabinanázy z Aspergillus aculeatus a její heterologní exprese v A. oryzae a tabáku". Molekulární genetika a genomika. 265 (5): 913–921. doi:10,1007 / s004380100489. ISSN 1617-4615.
- ^ A b Allen, Heather K; Moe, Luke A; Rodbumrer, Jitsupang; Gaarder, Andra; Handelsman, Jo (09.10.2008). „Funkční metagenomika odhaluje rozmanité β-laktamázy ve vzdálené aljašské půdě“. Časopis ISME. 3 (2): 243–251. doi:10.1038 / ismej.2008.86. ISSN 1751-7370. PMID 18843302.
- ^ Shyjan, Anne M .; Heldin, Paraskevi; Butcher, Eugene C .; Yoshino, Tadashi; Briskin, Michael J. (1996-09-20). "Funkční klonování cDNA pro lidskou hyaluronan syntázu". Journal of Biological Chemistry. 271 (38): 23395–23399. doi:10.1074 / jbc.271.38.23395. ISSN 0021-9258. PMID 8798544.
- ^ A b C d E Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James (2000). „Konstrukce knihoven DNA pomocí fága λ a dalších klonovacích vektorů“. Citovat deník vyžaduje
| deník =
(Pomoc) - ^ Mølhøj, Michael; Verma, Rajeev; Reiter, Wolf-Dieter (01.07.2004). „Biosyntéza d-galakturonátu v rostlinách. Funkční klonování a charakterizace membránou kotvené UDP-d-glukuronát 4-epimerázy z Arabidopsis“. Fyziologie rostlin. 135 (3): 1221–1230. doi:10.1104 / pp.104.043745. ISSN 0032-0889. PMC 519042. PMID 15247385.
- ^ Cheng, Jiujun; Romantsov, Tatyana; Engel, Katja; Doxey, Andrew C .; Rose, David R .; Neufeld, Josh D .; Charles, Trevor C. (03.03.2017). „Funkční metagenomika odhaluje nové β-galaktosidázy, které nelze předpovědět z genových sekvencí“. PLOS ONE. 12 (3): e0172545. Bibcode:2017PLoSO..1272545C. doi:10.1371 / journal.pone.0172545. ISSN 1932-6203. PMC 5342196. PMID 28273103.
- ^ Vester, Jan Kjølhede; Do očí bijící, Mikkel Andreas; Stougaard, Peter (2014-05-20). „Objev nových enzymů s průmyslovým potenciálem z chladného a alkalického prostředí kombinací funkční metagenomiky a kultivace“. Továrny na mikrobiální buňky. 13: 72. doi:10.1186/1475-2859-13-72. ISSN 1475-2859. PMC 4035831. PMID 24886068.
- ^ A b C d Puliti, Aldamaria; Caridi, Gianluca; Ravazzolo, Roberto; Ghiggeri, Gian Marco (01.12.2007). „Výuka molekulární genetiky: kapitola 4 - poziční klonování genetických poruch“. Dětská nefrologie. 22 (12): 2023–2029. doi:10.1007 / s00467-007-0548-5. ISSN 0931-041X. PMC 2908434. PMID 17661092.
- ^ A b Rand, Elizabeth B. (01.02.1998). „Genetický základ Alagilleova syndromu“. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 26 (2): 234–236. doi:10.1097/00005176-199802000-00024. ISSN 0277-2116.
- ^ Shendure, Jay; Balasubramanian, Shankar; Church, George M .; Gilbert, Walter; Rogers, Jane; Schloss, Jeffery A .; Waterston, Robert H. (2017). "Sekvenování DNA ve 40: minulost, přítomnost a budoucnost". Příroda. 550 (7676): 345–353. Bibcode:2017 Natur.550..345S. doi:10.1038 / příroda24286. ISSN 1476-4687. PMID 29019985.
- ^ „Mikrobiální sekvenování celého genomu“. www.illumina.com. Citováno 2018-02-27.
- ^ A b C d E F Wang, Jia-Wang; Wang, Amy; Li, Kunyu; Wang, Bangmei; Jin, Shunqian; Reiser, Michelle; Lockey, Richard F (2015). „Štěpení nukleázy CRISPR / Cas9 v kombinaci se sestavením Gibson pro bezproblémové klonování“. Biotechniky. 58 (4): 161–70. doi:10.2144/000114261. PMID 25861928.
- ^ A b C d Xu, Ruqiang; Qingshun, Li Quinn (2008-01-22). „Protokol: Zjednodušte klonování genů do binárních vektorů v Agrobacterium prostřednictvím vektorového systému Gateway® TOPO“. Rostlinné metody. 4: 4. doi:10.1186/1746-4811-4-4. ISSN 1746-4811. PMC 2257932. PMID 18211693.
- ^ A b C d Petersen, Lena K .; Stowers, R. Steven (09.09.2011). „Brána MultiSite Recombination Cloning Toolkit“. PLOS ONE. 6 (9): e24531. Bibcode:2011PLoSO ... 624531P. doi:10.1371 / journal.pone.0024531. ISSN 1932-6203. PMC 3170369. PMID 21931740.
- ^ Amann, Rudolf (2000). „Kdo je tam venku? Mikrobiální aspekty biologické rozmanitosti“. Systematická a aplikovaná mikrobiologie. 23 (1): 1–8. doi:10.1016 / s0723-2020 (00) 80039-9. PMID 10879972.
- ^ Kennedy, Jonathan; Marchesi, Julian R .; Dobson, Alan DW (2008-08-21). „Mořská metagenomika: strategie pro objev nových enzymů s biotechnologickými aplikacemi z mořského prostředí“. Továrny na mikrobiální buňky. 7: 27. doi:10.1186/1475-2859-7-27. ISSN 1475-2859. PMC 2538500. PMID 18717988.
- ^ A b C Garibyan, Lilit; Avashia, Nidhi (2013). „Polymerázová řetězová reakce“. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3): 1–4. doi:10.1038 / jid.2013.1. PMC 4102308. PMID 23399825.
- ^ A b C d E Moser, Michael J .; DiFrancesco, Robert A .; Gowda, Krishne; Klingele, Audrey J .; Sugar, Darby R .; Stocki, Stacy; Mead, David A .; Schoenfeld, Thomas W. (06.06.2012). „Thermostable DNA Polymerase from a Viral Metagenome Is a Potent RT-PCR Enzyme“. PLOS ONE. 7 (6): e38371. Bibcode:2012PLoSO ... 738371M. doi:10.1371 / journal.pone.0038371. ISSN 1932-6203. PMC 3366922. PMID 22675552.
- ^ A b C d E F G Sommer, Morten O. A .; Dantas, Gautam; Church, George M. (2009-08-28). „Funkční charakterizace rezervoáru odolnosti vůči antibiotikům v lidské mikroflóře“. Věda. 325 (5944): 1128–1131. Bibcode:2009Sci ... 325.1128S. doi:10.1126 / science.1176950. ISSN 0036-8075. PMC 4720503. PMID 19713526.
externí odkazy
- Funkční klonování, třídění a profilování exprese proteinů vázajících nukleové kyseliny Genome Research.com
- Nová strategie pro funkční klonování enzymů pomocí zobrazení filamentózního fága: případ nukleotidyltransferáz Oxford Journals]
- Molekulární genetika Cohenova syndromu Oddělení lékařské genetiky, Helsinská univerzita