Sestava Gibson - Gibson assembly

Gibsonské shromáždění je molekulární klonování metoda, která umožňuje spojení více DNA fragmenty v jediné izotermické reakci. Je pojmenována po jejím tvůrci Danielovi G. Gibsonovi, který byl technickým ředitelem a spoluzakladatelem společnosti Codex DNA.

Proces

Přehled sestavy Gibson

Celá reakce Gibson Assembly vyžaduje několik komponent s drobnými manipulacemi.[1]


Metoda může současně kombinovat až 15 fragmentů DNA na základě sekvenční identity. Vyžaduje to DNA fragmenty obsahují ~ 20 až 40 párů bází se překrývají se sousedními fragmenty DNA. Tyto fragmenty DNA jsou smíchány s koktejlem tří enzymů a dalšími složkami pufru.

Tři požadované aktivity enzymů jsou: exonukleáza, DNA polymeráza, a DNA ligáza.

  • Exonukleáza žvýká zpět DNA z 5 'konce, čímž neinhibuje aktivitu polymerázy a umožňuje, aby k reakci došlo v jednom jediném procesu.[1] Výsledné jednovláknové oblasti na sousedních fragmentech DNA mohou žíhat.
  • DNA polymeráza obsahuje nukleotidy k vyplnění jakýchkoli mezer.
  • DNA ligáza se kovalentně připojí k DNA sousedních segmentů, čímž odstraní veškeré škrábance v DNA.

Výsledným produktem jsou různé fragmenty DNA spojené do jednoho. Lze sestavit lineární nebo uzavřené kruhové molekuly.

K Gibson Assembly jsou dva přístupy. Jednostupňová metoda a dvoustupňová metoda. Obě metody lze provádět v jedné reakční nádobě. Metoda Gibson Assembly 1-Step umožňuje sestavení až 5 různých fragmentů pomocí jediného kroku izotermický proces. V této metodě se fragmenty a hlavní směs enzymů spojí a celá směs se inkubuje při teplotě 50 ° C po dobu až jedné hodiny. Pro vytváření složitějších konstruktů s až 15 fragmenty nebo pro konstrukty obsahující fragmenty od 100 bp do 10 kb se používá dvoustupňový přístup Gibson Assembly. Dvoustupňová reakce vyžaduje dvě oddělená přidání hlavní směsi; jeden pro krok exonukleázy a hybridizace a druhý pro kroky DNA polymerázy a ligace. Pro dvoustupňový přístup se k provedení procesu montáže používají různé inkubační teploty.

Výhody

Tato metoda sestavování DNA má mnoho výhod ve srovnání s konvenčním klonováním restrikčních enzymů / ligací rekombinantní DNA.

  • Po PCR není nutné žádné restrikční štěpení fragmentů DNA. Páteřní vektor však lze štěpit nebo syntetizovat pomocí PCR.
  • Je levnější a rychlejší než konvenční klonovací schémata, protože vyžaduje méně kroků a méně činidel.
  • Mezi dvěma fragmenty DNA nezůstává žádná jizva restrikčního místa, ale oblast mezi dvojvlákny a visícími konci je mírně citlivá na mutaci, když DNA polymeráza uzavírá mezery.
  • V jedné zkumavkové reakci lze kombinovat až 5 fragmentů DNA současně pomocí hlavní směsi enzymů v jednom kroku.
  • Pomocí dvoustupňové reakce lze kombinovat až 15 fragmentů současně. Ve dvoustupňovém přístupu se nejdříve provedou kroky exonukleázy a nasedání. Poté následuje přidání DNA polymerázy a ligázy ve druhém kroku.
  • Lze použít také metodu Gibson Assembly místně zaměřená mutageneze začlenit místně specifické mutace, jako jsou inzerce, delece a bodové mutace

Reference

  1. ^ A b Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3., Smith HO (2009). "Enzymatické sestavení molekul DNA až do několika set kilobází". Přírodní metody. 6 (5): 343–345. doi:10.1038 / nmeth.1318. PMID  19363495.

Další informace