Identifikace DNA adenin methyltransferázy - DNA adenine methyltransferase identification

Identifikace DNA adenin methyltransferázy, často zkráceně DamID,[1] je molekulární biologie protokol používaný k mapování vazebných míst DNA - a chromatin -vazba bílkoviny v eukaryoty. DamID identifikuje vazebná místa expresí navrhovaného proteinu vázajícího DNA jako a fúzní protein s DNA methyltransferáza. Vazba požadovaného proteinu na DNA lokalizuje methyltransferázu v oblasti vazebného místa. Adenin metylace se u eukaryot přirozeně nevyskytuje, a proto lze usoudit, že methylace adeninu v jakékoli oblasti byla způsobena fúzním proteinem, což znamená, že oblast je umístěna poblíž vazebného místa. DamID je alternativní metoda ChIP na čipu nebo ChIP-sekv.[2]

Popis

Zásada

nějaké blabla.
Princip DamID. Tento náčrt ukazuje idealizovaný pohled na omotanou molekulu DNA histony uvnitř jádra buňky. Enzym Dam (zelený) je fúzován s požadovaným proteinem (oranžový) expresí chimérické sekvence DNA. Zajímavý protein táhne Dam na své příbuzné cíle. Tethering vede k methylaci GATC v sousedství vazebného místa (červená), ale ne na dálku.

N6-methyladenin (m6A) je produktem přidání methylové skupiny (CH3) v poloze 6 adeninu. Tento modifikovaný nukleotid chybí u velké většiny eukaryot, s výjimkou C. elegans,[3] ale je rozšířený v bakteriálních genomech,[4] jako součást modifikace omezení nebo Oprava DNA systémy. v Escherichia coli, methylace adeninu je katalyzována adeninmethyltransferázou Přehrada (DNA adenin methyltransferáza), která katalyzuje methylaci adeninu výhradně v palindromické sekvenci GATC. Ektopická exprese Dam v eukaryotických buňkách vede k methylaci adeninu v GATC sekvencích bez dalších znatelných vedlejších účinků.

Na základě toho DamID spočívá ve fúzi Dam na požadovaný protein (obvykle protein, který interaguje s DNA, jako je transkripční faktory ) nebo chromatinová složka. Požadovaný protein tedy cílí Dam na jeho příbuzného in vivo vazebné místo, což vede k methylaci sousedních GATC. Přítomnost m6A, shodující se s vazebnými místy sledovaných proteinů, je odhalena methyl PCR.

Methyl PCR

V tomto testu je genom tráven DpnI, který snižuje pouze methylované GATC. Dvouvláknové adaptéry se známou sekvencí se poté ligují na konce generované DpnI. Ligační produkty jsou poté tráveny DpnII. Tento enzym štěpí nemetylované GATC a zajišťuje, že pouze fragmenty jsou ohraničeny po sobě methylované GATC jsou amplifikovány v následující PCR. Poté se provede PCR s primery odpovídajícími adaptéry, což vede ke specifické amplifikaci genomových fragmentů ohraničených methylovanými GATC.

Specifika DamID versus imunoprecipitace chromatinu

Chromatinová imuno-srážení, nebo (ChIP), je alternativní metoda pro stanovení vazby proteinu na specifická místa genomu. Na rozdíl od čipu DamID nevyžaduje konkrétní protilátka proti sledovanému proteinu. To na jedné straně umožňuje mapovat proteiny, pro které není taková protilátka k dispozici. Na druhou stranu to znemožňuje konkrétní mapování posttranslačně upraveno bílkoviny.

Dalším zásadním rozdílem je, že ChIP testuje, kde je protein zájmu je v danou dobu, zatímco DamID zkouší, kde je byl. Důvodem je to, že m6A zůstává v DNA poté, co zmizí fúzní protein Dam. U proteinů, které jsou na svých cílových místech vázány nebo nevázány, to nic nemění. To však může vést k silným rozdílům v případě proteinů, které klouzají po DNA (např. RNA polymeráza).

Známá předsudky a technické problémy

Předpětí methylace plazmidu

V závislosti na tom, jak se experiment provádí, může být DamID vystaven zkreslení metylací plazmidu. Protože plazmidy jsou obvykle amplifikovány E-coli kde je Dam přirozeně vyjádřen, jsou methylovány na každém GATC. Přechodně transfekce experimenty je DNA těchto plazmidů získána společně s DNA transfektovaných buněk, což znamená, že fragmenty plazmidu jsou amplifikovány v methyl PCR. Každá sekvence genomu, která sdílí homologie nebo identita s plazmidem se tak může jevit jako vázaná na požadovaný protein. To platí zejména o otevřený čtecí rámec požadovaného proteinu, který je přítomen jak v plazmidu, tak v genomu. v microarray experimenty lze toto zkreslení použít k zajištění hybridizace správného materiálu. U stabilních buněčných linií nebo plně transgenních zvířat není toto zkreslení pozorováno, protože není získána žádná plazmidová DNA.

Apoptóza

Apoptotické buňky degradují svou DNA v charakteristickém žebříčku nukleosomů. Tím se vytvoří fragmenty DNA, které lze ligovat a amplifikovat během procedury DamID (laboratoř van Steensel, nepublikovaná pozorování). Vliv těchto nukleosomálních fragmentů na vazebný profil proteinu není znám.

Rozlišení

Rozlišení DamID je funkcí dostupnosti sekvencí GATC v genomu. Protein lze mapovat pouze na dvou po sobě následujících místech GATC. Střední vzdálenost mezi fragmenty GATC je 205 bp v Drosophila (FlyBase vydání 5), 260 u myší (Mm9) a 460 u člověka (HG19). Upravený protokol (DamIP), který kombinuje imunoprecipitace m6A s variantou Dam s méně specifickým rozpoznáním cílového místa, lze použít k získání dat s vyšším rozlišením.[5]

Metody specifické pro buněčný typ

Hlavní výhodou DamID oproti sekvenci ChIP je, že lze profilovat vazebná místa pro proteiny v konkrétním typu buňky in vivo aniž by bylo nutné fyzické oddělení subpopulace buněk. To umožňuje zkoumání vývojových nebo fyziologických procesů na zvířecích modelech.

Cílené poškození

Cílený přístup DamID (TaDa) využívá fenomén reinitiace ribozomu k expresi Dam-fúzních proteinů na přiměřeně nízké úrovni pro DamID (tj. Dam je nesycující, čímž se vyhne toxicitě). Tento konstrukt může být kombinován s promotory specifickými pro buněčný typ, což vede k tkáňově specifické methylaci.[6][7] Tento přístup lze použít k testování vazby transkripčního faktoru na požadovaný buněčný typ nebo alternativně lze fúzovat s dam Pol II podjednotky k určení vazby RNA polymerázy a tím k odvození buněčně specifické genové exprese. Cílené DamID bylo prokázáno v Drosophila a myš[8][9] buňky.

FRT / FLP-out POŠKOZENO

BuID-specific DamID lze také dosáhnout použitím rekombinace zprostředkovanou excizi transkripce terminátor kazeta proti proudu od Dam-fúzního proteinu.[10] Terminátorová kazeta je obklopena FRT rekombinačními místy, která lze odstranit při kombinaci s tkáňově specifickou expresí FLP rekombináza. Po vyjmutí kazety se Dam-fúze exprimuje na nízké úrovni pod kontrolou bazálního promotoru.

Varianty

Kromě detekce standardních interakcí protein-DNA lze DamID použít k prozkoumání dalších aspektů biologie chromatinu.

Split DamID

Tuto metodu lze použít k detekci společné vazby dvou faktorů na stejnou genomickou místo. Dam methyláza může být exprimována ve dvou polovinách, které jsou fúzovány s různými sledovanými proteiny. Když se oba proteiny vážou na stejnou oblast DNA, Dam enzym se rekonstituuje a je schopen methylovat okolní GATC místa.[11]

Přístupnost chromatinu

Vzhledem k vysoké aktivitě enzymu vede exprese nevazeného Dam k methylaci všech oblastí přístupného chromatinu.[12][13] Tento přístup lze použít jako alternativu k ATAC-seq nebo DNAse-seq. V kombinaci s metodami DamID specifickými pro daný buněčný typ lze expresi nevázaného Dam použít k identifikaci promotorových nebo enhancerových oblastí specifických pro daný buněčný typ.

Interakce RNA-DNA

Varianta DamID známá jako RNA-DamID může být použita k detekci interakcí mezi molekulami RNA a DNA.[14] Tato metoda se opírá o expresi fúzního proteinu Dam-MCP, který je schopen vázat se na RNA, která byla modifikována MS2 kmenové smyčky. Vazba Dam-fúzního proteinu na RNA vede k detekovatelné methylaci v místech RNA vázajících se na genom.

Dálkové regulační interakce

Sekvence DNA distálně od vazebného místa pro protein mohou být přivedeny do fyzické blízkosti smyčkováním chromozomů. Například takové interakce zprostředkovávají zesilovač a promotér funkce. Tyto interakce lze detekovat pomocí Damovy methylace. Pokud je Dam zaměřen na konkrétní známý lokus DNA, budou distální místa přivedená do blízkosti v důsledku 3D konfigurace DNA také methylována a lze je detekovat jako v konvenčním DamID.[15]

Jednobuněčný DamID

DamID se obvykle provádí na přibližně 10 000 buňkách,[16] (i když to bylo prokázáno s méně[6]). To znamená, že získaná data představují průměrnou vazbu nebo pravděpodobnost vazebné události v celé populaci buněk. Byl také vyvinut protokol DamID pro jednotlivé buňky a aplikován na lidské buňky.[17] Přístupy s jednou buňkou mohou zvýraznit heterogenitu asociací chromatinu mezi buňkami.

Reference

  1. ^ van Steensel B, Henikoff S (duben 2000). "Identifikace in vivo cílů DNA proteinů chromatinu pomocí uvázané dam methyltransferázy". Přírodní biotechnologie. 18 (4): 424–8. doi:10.1038/74487. PMID  10748524.
  2. ^ Aughey GN, Southall TD (leden 2016). "Dam, to je dobré! DamID profilování interakcí protein-DNA". Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 5 (1): 25–37. doi:10,1002 / wdev.205. PMC  4737221. PMID  26383089.
  3. ^ Shi, Yang; On, Chuan; Aravind, L .; Hsu, Chih-Hung; Aristizábal-Corrales, David; Liu, Jianzhao; Sendinc, Erdem; Gu, Lei; Blanco, Mario Andres (07.05.2015). „Methylace DNA na N6-adenin v C. elegans“. Buňka. 161 (4): 868–878. doi:10.1016 / j.cell.2015.04.005. ISSN  0092-8674. PMC  4427530. PMID  25936839.
  4. ^ Brooks JE, Roberts RJ (únor 1982). "Modifikační profily bakteriálních genomů". Výzkum nukleových kyselin. 10 (3): 913–34. doi:10.1093 / nar / 10.3.913. PMC  326211. PMID  6278441.
  5. ^ Xiao R, Roman-Sanchez R, Moore DD (duben 2010). „DamIP: nová metoda k identifikaci vazebných míst DNA in vivo“. Signalizace jaderného receptoru. 8: e003. doi:10.1621 / nrs.08003. PMC  2858267. PMID  20419059.
  6. ^ A b Southall TD, Gold KS, Egger B, Davidson CM, Caygill EE, Marshall OJ, Brand AH (červenec 2013). „Specifické profilování genové exprese a vazby chromatinu bez buněčné izolace podle typu buňky: analýza obsazení RNA Pol II v nervových kmenových buňkách. Vývojová buňka. 26 (1): 101–12. doi:10.1016 / j.devcel.2013.05.020. PMC  3714590. PMID  23792147.
  7. ^ Marshall OJ, Southall TD, Cheetham SW, značka AH (září 2016). „Specifické profilování buněčných typů interakcí protein-DNA bez izolace buněk pomocí cíleného DamID s sekvenováním příští generace“. Přírodní protokoly. 11 (9): 1586–98. doi:10.1038 / nprot.2016.084. hdl:10044/1/31094. PMC  7032955. PMID  27490632.
  8. ^ Tosti L, Ashmore J, Tan BS, Carbone B, Mistri TK, Wilson V, Tomlinson SR, Kaji K (duben 2018). „Mapování obsazení transkripčního faktoru pomocí minimálního počtu buněk in vitro a in vivo“. Výzkum genomu. 28 (4): 592–605. doi:10,1101 / gr.227124.117. PMC  5880248. PMID  29572359.
  9. ^ Cheetham, Seth W .; Gruhn, Wolfram H .; van den Ameele, Jelle; Krautz, Robert; Southall, Tony D .; Kobayashi, Toshihiro; Surani, M. Azim; Brand, Andrea H. (05.09.2018). „Targeted DamID odhaluje rozdílné vázání faktorů pluripotence savců“. Rozvoj. 145 (20): dev.170209. doi:10.1242 / dev.170209. ISSN  1477-9129. PMC  6215400. PMID  30185410.
  10. ^ Pindyurin AV, Pagie L, Kozhevnikova EN, van Arensbergen J, van Steensel B (červenec 2016). "Indukovatelné systémy DamID pro genomové mapování proteinů chromatinu v Drosophile". Výzkum nukleových kyselin. 44 (12): 5646–57. doi:10.1093 / nar / gkw176. PMC  4937306. PMID  27001518.
  11. ^ Hass MR, Liow HH, Chen X, Sharma A, Inoue YU, Inoue T, Reeb A, Martens A, Fulbright M, Raju S, Stevens M, Boyle S, Park JS, Weirauch MT, Brent MR, Kopan R (srpen 2015 ). „SpDamID: Označení DNA vázané proteinovými komplexy identifikuje látky zvyšující odezvu na Notch-Dimer“. Molekulární buňka. 59 (4): 685–97. doi:10.1016 / j.molcel.2015.07.008. PMC  4553207. PMID  26257285.
  12. ^ Vína DR, Talbert PB, Clark DV, Henikoff S (1996). "Zavedení DNA methyltransferázy do Drosophily pro zkoumání struktury chromatinu in vivo". Chromozom. 104 (5): 332–40. doi:10.1007 / BF00337221. PMID  8575244.
  13. ^ Aughey GN, Estacio Gomez A, Thomson J, Yin H, Southall TD (únor 2018). „CATaDa odhaluje globální remodelaci dostupnosti chromatinu během diferenciace kmenových buněk in vivo“. eLife. 7. doi:10,7554 / eLife.32341. PMC  5826290. PMID  29481322.
  14. ^ Cheetham SW, značka AH (leden 2018). „RNA-DamID odhaluje specifické navázání roX RNA na buněčný typ v místech vstupu chromatinu“. Přírodní strukturní a molekulární biologie. 25 (1): 109–114. doi:10.1038 / s41594-017-0006-4. PMC  5813796. PMID  29323275.
  15. ^ Cléard F, Moshkin Y, Karch F, Maeda RK (srpen 2006). „Zkoumání regulačních interakcí na dálku v komplexu Drosophila melanogaster bithorax pomocí identifikace Dam“. Genetika přírody. 38 (8): 931–5. doi:10.1038 / ng1833. PMID  16823379.
  16. ^ Marshall, Owen J .; Southall, Tony D .; Cheetham, Seth W .; Brand, Andrea H. (září 2016). „Specifické profilování buněčných typů interakcí protein-DNA bez izolace buněk pomocí cíleného DamID s sekvenováním příští generace“. Přírodní protokoly. 11 (9): 1586–1598. doi:10.1038 / nprot.2016.084. hdl:10044/1/31094. ISSN  1750-2799. PMC  7032955. PMID  27490632.
  17. ^ Druh, Jop; Pagie, Ludo; de Vries, Sandra S .; Nahidiazar, Leila; Dey, Siddharth S .; Bienko, Magda; Zhan, Ye; Lajoie, Bryan; de Graaf, Carolyn A. (2015-09-24). „Mapy interakcí nukleární laminy v jednotlivých lidských buňkách v celém genomu“. Buňka. 163 (1): 134–147. doi:10.1016 / j.cell.2015.08.040. ISSN  1097-4172. PMC  4583798. PMID  26365489.

Další čtení

externí odkazy