Biotinylace - Biotinylation

v biochemie, biotinylace je proces kovalentního připojení biotin na protein, nukleovou kyselinu nebo jinou molekulu. Biotinylace je rychlá, specifická a je nepravděpodobné, že by narušila přirozenou funkci molekuly kvůli malé velikosti biotinu (MW = 244,31 g / mol). Biotin se váže na streptavidin a avidin s extrémně vysokou afinitou, rychlou rychlostí a vysokou specificitou a tyto interakce se využívají v mnoha oblastech biotechnologie k izolaci požadovaných biotinylovaných molekul. Vazba biotinu na streptavidin a avidin je odolná vůči extrémním teplotám, pH a proteolýze, což umožňuje zachycení biotinylovaných molekul v nejrůznějších prostředích. Také mnohočetný biotin molekuly může být konjugované na požadovaný protein, který umožňuje vazbu více streptavidin, avidin nebo neutravidin proteinové molekuly a zvyšuje citlivost detekce sledovaného proteinu. K dispozici je velké množství biotinylačních činidel, která využívají širokou škálu možných metod značení. Vzhledem k silné afinitě mezi biotinem a streptavidinem bylo čištění biotinylovaných proteinů široce používaným přístupem k identifikaci interakcí protein-protein a posttranslačních událostí, jako je ubikvitylace[1] v molekulární biologii.

Metody označování

Proteiny mohou být biotinylovány chemicky nebo enzymaticky. Chemická biotinylace využívá různé konjugační chemie k získání nespecifické biotinylace aminů, karboxylátů, sulfhydrylů a sacharidů (např. NHS-vazba poskytuje biotinylaci jakýchkoli primárních aminů v proteinu). Enzymatická biotinylace vede k biotinylaci specifického lysinu v určité sekvenci bakteriální biotin ligázou.[2] Většina chemických biotinylačních činidel sestává z reaktivní skupiny připojené prostřednictvím linkeru k postrannímu řetězci biotinu s kyselinou valerovou. Protože biotinová vazebná kapsa v avidinu / streptavidinu je pohřbena pod povrchem proteinu, jsou žádoucí biotinylační činidla s delším linkerem, protože umožňují molekule biotinu, jakmile je navázána na svůj cíl, být přístupnější pro vazbu avidinu / streptavidinu / Neutravidinový protein. Tento linker může také zprostředkovat rozpustnost biotinylačních činidel; linkery, které obsahují poly (ethylen) glykol (PEG) může činit ve vodě nerozpustná činidla rozpustná nebo zvýšit rozpustnost biotinylačních činidel, která jsou již do určité míry rozpustná.

Enzymatická biotinylace

Na rozdíl od chemických biotinylačních metod umožňuje enzymatická biotinylace navázání biotinu na přesně jeden zbytek přítomný v proteinu. Tuto biotinylační reakci lze také dokončit, což znamená, že produkt je generován s vysokou uniformitou a lze na něj navazovat streptavidin v definované orientaci, např. pro Multimery MHC. Enzymatickou biotinylaci nejčastěji provádí E-coli biotin holoenzym syntetáza, také známý jako biotin ligáza (BirA, P06709).[3][4]

Nejběžnějším způsobem cílení na požadovaný protein je fúze proteinu na jeho N-konci, C-konci nebo ve vnitřní smyčce na peptid s 15 aminokyselinami (GLNDIFEAQKIEWHE), nazývané AviTag nebo Acceptor Peptide (AP).[5] Po označení je protein inkubován s BirA, což umožňuje biotinylaci v přítomnosti biotinu a ATP.[5] Lze provést enzymatickou biotinylaci in vitro ale BirA také specificky reaguje se svým cílovým peptidem uvnitř savčích a bakteriálních buněk a na buněčném povrchu, zatímco jiné buněčné proteiny nejsou modifikovány.[6][7][8] Může také probíhat enzymatická biotinylace in vivo typicky prostřednictvím společné exprese proteinu značeného Avitag a BirA.[9]

Přírodní substrát BirA je biotin karboxylový nosný protein (BCCP). Než byly objeveny menší značky, bylo třeba zacílit protein na celý BCCP.[10] Protein fúzovaný pomocí BCCP lze rozpoznat podle molekul biotinu in vivo a připojit se k tomu.[11] Před AviTag bylo použito několik dalších malých značek, ale AviTag je zatím nejúčinnější.[4]

Biotinylace primárních aminů

Nejběžnější cíle pro úpravy protein molekuly jsou primární aminové skupiny, které jsou přítomny jako lysinový postranní řetězec epsilon-aminy a N-koncové a-aminy. Aminově reaktivní biotinylační činidla lze rozdělit do dvou skupin na základě vody rozpustnost.

N-hydroxysukcinimid (NHS) estery mají špatnou rozpustnost v vodný řešení. U reakcí ve vodném roztoku musí být nejprve rozpuštěn v organický solventní, pak se zředí do vodné reakce směs. Nejběžněji používanými organickými rozpouštědly pro tento účel jsou dimethylsulfoxid (DMSO) a dimethylformamid (DMF), které jsou kompatibilní s většinou proteinů v nízkých koncentracích. Vzhledem k hydrofobicitě NHS-esterů mohou biotinylační činidla NHS také difundovat přes buněčná membrána, což znamená, že budou biotinylovat jak vnitřní, tak vnější složky a buňka.

Biotin NHS lysinová reakce.png

Sulfo-NHS estery jsou rozpustnější ve vodě a měly by být rozpuštěny ve vodě těsně před použitím, protože snadno hydrolyzují. Rozpustnost sulfo-NHS-esterů ve vodě pochází z jejich sulfonát skupina na N-hydroxysukcinimid a eliminuje potřebu rozpouštět činidlo v organickém rozpouštědle. Sulfo-NHS-estery biotinu lze také použít jako biotinylační činidla na povrchu buněk, protože nepronikají buněčná membrána.

Chemické reakce NHS- a sulfo-NHS esterů jsou v podstatě identické v tom, že oba spontánně reagují s aminy za vzniku amidové vazby. Protože cílem pro ester je deprotonovaný primární amin, je reakce upřednostňována za bazických podmínek (nad pH 7). Hydrolýza NHS esteru je hlavní konkurenční reakce a rychlost hydrolýzy se zvyšuje s rostoucí pH. NHS- a sulfo-NHS-estery mají a poločas rozpadu několik hodin při pH 7, ale pouze několik minut při pH 9.

Existuje určitá flexibilita v podmínkách pro konjugaci NHS-esterů s primárními aminy. Inkubační teploty se mohou pohybovat od 4 do 37 ° C, hodnoty pH v reakčním rozmezí od 7 do 9 a inkubační doby se pohybují od několika minut do 12 hodin. Pufry obsahující aminy (např Tris nebo glycin ) je třeba se vyvarovat, protože konkurují reakci.

Sulfhydryl biotinylace

Alternativou k primární biotinylaci aminu je označení sulfhydrylových skupin biotinem. Protože zdarma sulfhydryl skupiny jsou na většině proteinů méně rozšířené ve srovnání s primárními aminy, je vhodná biosulfinylová biotinylace, pokud jsou primární aminy umístěny v regulační doméně (doménách) cílového proteinu nebo když je vyžadována snížená úroveň biotinylace. Sulfhydryl-reaktivní skupiny, jako je maleimidy, halogenacetyly a pyridyldisulfidy, vyžadují pro konjugaci volné sulfhydrylové skupiny; disulfidové vazby musí být nejprve redukovány, aby se uvolnily sulfhydrylové skupiny pro biotinylaci. Pokud nejsou k dispozici žádné volné sulfhydrylové skupiny, lze lysiny modifikovat různými thiolace činidla (Trautovo činidlo, SAT (PEG4), SATA a SATP), což vede k přidání volného sulfhydrylu. Sulfhydryl biotinylace se provádí při mírně nižším pH (6,5-7,5) než značení NHS estery.

Biotin-maleimidová cysteinová reakce.png

Kromě celých proteinů biotinylovaných peptidy lze syntetizovat zavedením a cystein (Cys) zbytek během syntézy na konci aminokyselinového řetězce k získání místně specifické a orientované biotinylace. Nukleotidy mohou být také biotinylovány zabudováním biotinylovaných nukleotidy.

Karboxylová biotinylace

Karboxylové skupiny se nacházejí na C-koncových koncích proteinů a na postranních řetězcích aminokyselin glutamátu a aspartátu. Biotinylační činidla, která cílí na karboxylové skupiny, nemají karboxy-reaktivní skupinu jako takovou, ale místo toho se spoléhají na karbodiimid síťovadlo, jako je EDC vázat primární amin na biotinylačních činidlech na karboxylovou skupinu na cílovém proteinu.

Biotinylace na karboxylových skupinách probíhá při pH 4,5–5,5. Aby se zabránilo křížové reaktivitě síťovadla se složkami pufru, neměly by pufry obsahovat primární aminy (např. Tris, glycin ) nebo karboxyly (např. acetát, citrát ); MES nárazník je ideální volbou.

Biotinylace glykoproteinu

Glykoproteiny lze biotinylovat úpravou uhlohydrát zbytky do aldehydy, které pak reagují s hydrazin - nebo biotinylační činidla na bázi alkoxyaminu. Jodistan sodný oxiduje kyseliny sialové na glykoproteinech na aldehydy za vzniku těchto stabilních vazeb při pH 4–6.

Polyklonální protilátky jsou silně glykosylované a protože glykosylace neinterferuje s aktivitou protilátky, je biotinylace glykosylových skupin ideální strategií pro generování biotinylovaných protilátek.

Biotinylace oligonukleotidů

Oligonukleotidy jsou v průběhu roku snadno biotinylované syntéza oligonukleotidů fosforamiditovou metodou za použití komerčního biotin fosforamiditu.[12] Po standardní deprotekci mohou být získané konjugáty čištěny pomocí HPLC s reverzní fází nebo aniontoměničovou HPLC

Nespecifická biotinylace

Fotoaktivovatelná biotinylační činidla jsou ideální, pokud pro označení nejsou k dispozici primární aminy, sulfhydryly, karboxyly a sacharidy. Tato činidla se spoléhají na arylazidy, které se aktivují ultrafialové světlo (UV;> 350 nm), které pak reagují na C-H a N-H vazbách. Protože se tyto typy vazeb vyskytují nezávisle na typu aminokyseliny, tento typ biotinylace se nazývá „nespecifický“.

Fotoaktivovatelná biotinylační činidla lze také použít k aktivaci biotinylace v určitých časech v experimentu nebo během určitých reakčních podmínek, jednoduše vystavením reakce UV světlo v konkrétní čas nebo podmínku.

Účel

Čištění

Značku biotinu lze použít v afinitní chromatografie společně se sloupcem, který má avidin (nebo streptavidin nebo neutravidin ), který je k němu vázán, což je přirozený ligand pro biotin. K rozbití interakce avidin / streptavidin - biotin jsou však nutné drsné podmínky (např. 6M GuHCl při pH 1,5), které s největší pravděpodobností denaturují protein nesoucí biotinovou značku. Pokud je nutná izolace značeného proteinu, je lepší protein označit iminobiotin. Tento analog biotinu silně váže na avidin / streptavidin při alkalickém pH, ale afinita se snižuje při snižování pH. Proto může být funkční protein značený iminobiotinem uvolněn ze sloupce avidin / streptavidin snížením pH (přibližně na pH 4).[13][14]

Detekce

Tuto značku lze také použít k detekci proteinu pomocí anti-biotinu protilátky nebo detekční strategie značené avidinem / streptavidinem, jako jsou reportéry enzymů (např. křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza ) nebo fluorescenční sondy. To může být užitečné při lokalizaci fluorescenční nebo elektronovou mikroskopií,[15] ELISA testy, ELISPOT testy, západní bloty a další imunoanalytické metody. Detekce monovalentním streptavidinem může zabránit shlukování nebo agregaci biotinylovaného cíle.[16]

Jiná použití

The nekovalentní vazba vytvořený mezi biotinem a avidinem nebo streptavidinem má vazebnou afinitu, která je vyšší než většina vazeb antigenu a protilátky a přibližuje se síle kovalentní vazba. Tato velmi těsná vazba činí značení proteinů biotinem užitečným nástrojem pro aplikace, jako je afinitní chromatografie použití imobilizovaného avidinu nebo streptavidinu k oddělení biotinylovaného proteinu od směsi jiných proteinů a biochemikálií. Biotinylovaný protein, jako je biotinylovaný hovězí sérový albumin (BSA), se používá v testech na pevné fázi jako potah na povrchu jamky na destičkách s více jamkami. Biotinylace červené krvinky byl použit jako prostředek ke stanovení celkového objemu krve bez použití radioaktivních štítků, jako je chrom 51, umožňující stanovení objemu u kojenců s nízkou porodní hmotností a těhotných žen, které by jinak nemohly být vystaveny požadovaným dávkám radioaktivity. Dále biotinylace Molekuly MHC vytvořit Multimery MHC se stal užitečným nástrojem pro identifikaci a izolaci antigen-specifických T-buňka populace. Poslední dobou, in vivo biotinylace proteinů byla vyvinuta ke studiu interakcí protein-protein a blízkost v živých buňkách[17][18][19]

Stanovení rozsahu biotinylace

Reakční podmínky pro biotinylaci se volí tak, aby cílová molekula (např. Protilátka) byla značena dostatečným množstvím biotinových molekul k čištění nebo detekci molekuly, ale ne natolik, aby biotin interferoval s funkcí molekuly.

Stanovení HABA

Ke stanovení rozsahu biotinylace lze použít test HABA (kyselina 2- (4-hydroxyazobenzen) benzoová). HABA barvivo je vázáno na avidin nebo streptavidin a poskytuje charakteristickou absorbanci. Když se zavedou biotinylované proteiny nebo jiné molekuly, biotin vytlačí barvivo, což vede ke změně absorbance při 500 nm. Tato změna je přímo úměrná úrovni biotinu ve vzorku. Nevýhodou testu HABA je, že používá velké množství vzorku.

Posun streptavidinu v gelu

Míra biotinylace může být také měřena streptavidinovým gelovým posunem, protože streptavidin zůstává vázán na biotin během elektroforéza na agarózovém gelu nebo elektroforéza na polyakrylamidovém gelu. Podíl biotinylovaného cíle lze měřit změnou intenzity pásma cíle s přebytkem streptavidinu nebo bez něj, což lze rychle a kvantitativně zjistit u biotinylovaných proteinů Coomassie Brilliant Blue barvení.[20]

Reference

  1. ^ Lectez, Benoît; Migotti, Rebekka; Lee, tak mladý; Ramirez, Juanma; Beraza, Naiara; Mansfield, Bill; Sutherland, James D .; Martinez-Chantar, Maria L .; Dittmar, Gunnar (06.06.2014). "Profilování ubikvitinu v játrech pomocí transgenní myši s biotinylovaným ubikvitinem". Journal of Proteome Research. 13 (6): 3016–3026. doi:10.1021 / pr5001913. ISSN  1535-3893. PMID  24730562.
  2. ^ Barat, Bhaswati; Wu, Anna M. (2007). "Metabolická biotinylace rekombinantní protilátky biotin ligázou zadrženou v endoplazmatickém retikulu". Biomolekulární inženýrství. 24 (3): 283–91. doi:10.1016 / j.bioeng.2007.02.003. PMC  2682619. PMID  17379573.
  3. ^ Samols, D .; Thornton, C. G .; Murtif, V. L .; Kumar, G. K .; Haase, F. C .; Wood, H. G. (1988-05-15). "Evoluční konzervace mezi biotinovými enzymy". The Journal of Biological Chemistry. 263 (14): 6461–6464. ISSN  0021-9258. PMID  2896195.
  4. ^ A b Fairhead, M; Howarth, M (2015). Místně specifická biotinylace purifikovaných proteinů pomocí BirA. Metody v molekulární biologii. 1266. 171–84. doi:10.1007/978-1-4939-2272-7_12. ISBN  978-1-4939-2271-0. PMC  4304673. PMID  25560075.
  5. ^ A b Beckett, Dorothy; Kovaleva, Elena; Schatz, Peter J. (1999). „Minimální peptidový substrát v biotinylaci katalyzované biotin holoenzym syntetázou“. Věda o bílkovinách. 8 (4): 921–9. doi:10.1110 / ps.8.4.921. PMC  2144313. PMID  10211839.
  6. ^ De Boer, E .; Rodriguez, P; Bonte, E; Krijgsveld, J; Katsantoni, E; Sakra, A; Grosveld, F; Strouboulis, J (2003). "Efektivní biotinylace a jednokrokové čištění značených transkripčních faktorů v savčích buňkách a transgenních myších". Sborník Národní akademie věd. 100 (13): 7480–5. Bibcode:2003PNAS..100.7480D. doi:10.1073 / pnas.1332608100. PMC  164612. PMID  12802011.
  7. ^ Viens, Antoine; Mechold, Undine; Lehrmann, Heike; Harel-Bellan, Annick; Ogryzko, Vasily (2004). "Využití biotinylace proteinů in vivo pro imunoprecipitaci chromatinu". Analytická biochemie. 325 (1): 68–76. doi:10.1016 / j.ab.2003.10.015. PMID  14715286.
  8. ^ Howarth, Mark; Takao, Keizo; Hayashi, Yasunori; Ting, Alice Y. (2005). „Cílení kvantových teček na povrchové proteiny v živých buňkách pomocí biotin ligázy“. Sborník Národní akademie věd. 102 (21): 7583–8. Bibcode:2005PNAS..102,7583H. doi:10.1073 / pnas.0503125102. JSTOR  3375578. PMC  1129026. PMID  15897449.
  9. ^ Cull, M. G .; Schatz, P. J. (01.01.2000). Biotinylace proteinů in vivo a in vitro pomocí malých peptidových značek. Metody v enzymologii. 326. 430–440. doi:10.1016 / s0076-6879 (00) 26068-0. ISBN  9780121822279. ISSN  0076-6879. PMID  11036656.
  10. ^ Argaraña, CE; Kuntz, ID; Birken, S; Axel, R; Cantor, ČR (1986). "Molekulární klonování a nukleotidová sekvence genu streptavidinu". Nucleic Acids Res. 14 (4): 1871–82. doi:10.1093 / nar / 14.4.1871. PMC  339579. PMID  3951999.
  11. ^ „Biotinace proteinů in vivo“.
  12. ^ Pon, Richard T. (1991). „Biotin fosforamiditové činidlo s dlouhým řetězcem pro automatizovanou syntézu 5′-biotinylovaných oligonukleotidů“. Čtyřstěn dopisy. 32 (14): 1715–8. doi:10.1016 / S0040-4039 (00) 74311-5.
  13. ^ Hofmann, Klaus; Wood, Sara W .; Brinton, Charles C .; Montibeller, Judith A .; Finn, Frances M. (1980). "Sloupce s afinitou k iminobiotinu a jejich aplikace při získávání streptavidinu". Sborník Národní akademie věd. 77 (8): 4666–8. Bibcode:1980PNAS ... 77,4666H. doi:10.1073 / pnas.77.8.4666. JSTOR  9166. PMC  349906. PMID  6933515.
  14. ^ Sugawara, Kazuharu; Kamiya, Naoto; Hirabayashi, George; Kuramitz, Hideki (2005). „Voltametrická homogenní vazebná zkouška biotinu bez separačního kroku s použitím iminobiotinu značeného elektroaktivní sloučeninou“. Analytické vědy. 21 (8): 897–900. doi:10,2116 / analsci.21.897. PMID  16122157.
  15. ^ Viens, A .; Harper, F .; Pichard, E .; Comisso, M .; Pierron, G .; Ogryzko, V. (2008). „Využití biotinylace proteinů in vivo pro imunoelektronovou mikroskopickou lokalizaci specifické proteinové izoformy“. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (10): 911–9. doi:10.1369 / jhc.2008.951624. PMC  2544619. PMID  18574249.
  16. ^ Howarth, Mark; Chinnapen, Daniel J-F; Gerrow, Kimberly; Dorrestein, Pieter C; Grandy, Melanie R; Kelleher, Neil L; El-Husseini, Alaa; Ting, Alice Y (2006). „Monovalentní streptavidin s jediným femtomolárním biotinovým vazebným místem“. Přírodní metody. 3 (4): 267–73. doi:10.1038 / nmeth861. PMC  2576293. PMID  16554831.
  17. ^ FernáNdez-SuáRez, Marta; Chen, T. Scott; Ting, Alice Y. (2008). "Detekce interakce proteinů a proteinů in vitro a v buňkách proximální biotinylací". Journal of the American Chemical Society. 130 (29): 9251–3. doi:10.1021 / ja801445p. PMC  2635094. PMID  18582056.
  18. ^ Kulyyassov, Arman; Shoaib, Muhammad; Pichugin, Andrei; Kannouche, Patricia; Ramanculov, Erlan; Lipinski, Marc; Ogryzko, Vasily (2011). „PUB-MS: Metoda monitorování protein-proximityin vivo založená na hmotnostní spektrometrii“. Journal of Proteome Research. 10 (10): 4416–27. arXiv:1108.5657. doi:10.1021 / pr200189p. PMID  21842862. S2CID  16887424.
  19. ^ Shoaib, M .; Kulyyassov, A .; Robin, C .; Winczura, K .; Tarlykov, P .; Despas, E .; Kannouche, P .; Ramanculov, E .; Lipinski, M .; Ogryzko, V. (2012). Přístup „PUB-NChIP -„ biotinylace in vivo “ke studiu chromatinu v blízkosti požadovaného proteinu“. Výzkum genomu. 23 (2): 331–40. doi:10,1101 / gr. 134874.111. PMC  3561874. PMID  23038767.
  20. ^ Jain, J .; Veggiani, G .; Howarth, M. (2013). „Načítání cholesterolu a ultrastabilní proteinové interakce určují hladinu nádorového markeru potřebnou pro optimální izolaci rakovinných buněk“. Výzkum rakoviny. 73 (7): 2310–21. doi:10.1158 / 0008-5472.CAN-12-2956. PMC  3618857. PMID  23378340.

Další čtení