Brokovnice proteomika - Shotgun proteomics

Brokovnice proteomika odkazuje na použití proteomika zdola nahoru techniky identifikace bílkoviny ve složitých směsích za použití kombinace vysoce účinná kapalinová chromatografie zkombinováno s hmotnostní spektrometrie.[1][2][3][4][5][6] Název je odvozen od sekvenování brokovnice z DNA který je sám pojmenován po rychle se rozvíjejícím, kvazi náhodném vzoru střelby a brokovnice. Nejběžnější metoda brokovnice proteomika začíná tím, že jsou obsaženy proteiny ve směsi strávený a výsledný peptidy se oddělí kapalinovou chromatografií. Tandemová hmotnostní spektrometrie se potom použije k identifikaci peptidů.

Cílená proteomika pomocí SRM a získávání nezávislé na datech metody jsou často považovány za alternativy k brokovnicové proteomice v oblasti proteomika zdola nahoru. Zatímco proteomika brokovnic využívá na generování skenů fragmentových iontů závislý výběr prekurzorových iontů, výše uvedené metody používají pro získávání skenů fragmentových iontů deterministickou metodu.

Dějiny

Brokovnice proteomika vznikla z obtíží při použití předchozích technologií k oddělení složitých směsí. V roce 1975 byla provedena dvourozměrná elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (2D STRÁNKA ) popsali O’Farrell a Klose se schopností rozložit složité proteinové směsi.[7][8] Vývoj iontové laserové desorpce pomocí ionizace maticí (MALDI ), ionizace elektrosprejem (ESI ) a vyhledávání v databázi pokračovalo v rozšiřování oblasti proteomiky. Tyto metody však stále měly potíže s identifikací a oddělením proteinů s nízkou četností, aberantních proteinů a membránových proteinů. Brokovnice proteomika se ukázal jako metoda, která by mohla vyřešit i tyto proteiny.[5]

Výhody

Brokovnice proteomika umožňuje globální identifikaci bílkovin, stejně jako schopnost systematicky profilovat dynamické proteomy.[9] Rovněž se vyhýbá nízké účinnosti separace a špatné hmotnostní spektrální citlivosti spojené s analýzou intaktního proteinu.[1]

Nevýhody

Filtrování dynamického vyloučení, které se často používá v proteomice brokovnic, maximalizuje počet identifikovaných proteinů na úkor náhodného vzorkování.[10] Tento problém může být umocněn podvzorkováním, které je vlastní proteomice brokovnic.[11]

Agilent 1200 HPLC
Quadrupole Time-Of-Flight tandemový hmotnostní spektrometr (Q-TOF)

Pracovní postup

Buňky obsahující požadovaný proteinový komplement se pěstují. Poté se ze směsi extrahují proteiny a štěpí se proteázou za vzniku peptidové směsi.[9] Peptidová směs se poté vloží přímo na mikrokapilární kolonu a peptidy se oddělí hydrofobicitou a nábojem. Jako peptidy eluovat ze kolony jsou ionizovány a odděleny m / z v první fázi tandemová hmotnostní spektrometrie. Vybrané ionty podstoupí kolize vyvolaná disociace nebo jiný proces k vyvolání fragmentace. Nabité fragmenty se oddělí ve druhém stupni tandemové hmotnostní spektrometrie.

"Otisk prstu" hmotnostního spektra fragmentace každého peptidu se používá k identifikaci proteinu, ze kterého pochází, hledáním proti databázi sekvencí pomocí komerčně dostupného softwaru (např. SEQUEST nebo MASKOT ).[9] Příklady sekvenčních databází jsou databáze Genpept nebo databáze PIR.[12] Po prohledání databáze je třeba vyhodnotit platnost každé shody peptidového spektra (PSM).[13] Tato analýza umožňuje vědcům profilovat různé biologické systémy.[9]

Problémy s identifikací peptidů

Peptidy, které jsou zdegenerované (sdílené dvěma nebo více proteiny v databázi), mohou ztížit identifikaci proteinu, ke kterému patří. Některé vzorky proteomů obratlovců mají navíc velký počet paralogy. A konečně, alternativní sestřih u vyšších eukaryot může vést k mnoha identickým proteinovým subsekvencím.[1]

Praktické aplikace

Po sekvenování lidského genomu je dalším krokem ověření a funkční anotace všech předpovězených genů a jejich proteinových produktů.[4] Brokovnici proteomiku lze použít pro funkční klasifikaci nebo srovnávací analýzu těchto proteinových produktů. Může být použit v projektech od velkého celého proteomu po zaměření na jednu rodinu proteinů. To lze provést ve výzkumných laboratořích nebo komerčně.

Rozsáhlá analýza

Jedním z příkladů je studie společnosti Washburn, Wolters a Yates, ve které použili proteomiku brokovnice na proteomu Saccharomyces cerevisiae kmen pěstovaný do střední logaritmické fáze. Byli schopni detekovat a identifikovat 1484 proteinů a také identifikovat proteiny, které se zřídka vyskytují v analýze proteomu, včetně proteinů s nízkým výskytem, ​​jako je transkripční faktory a proteinové kinázy. Byli také schopni identifikovat 131 proteinů se třemi nebo více předpokládanými transmembránové domény.[2]

Rodina proteinů

Vaisar a kol. používá proteomiku brokovnic k implikaci inhibice proteázy a aktivace komplementu v protizánětlivých vlastnostech lipoprotein s vysokou hustotou.[14] Ve studii Lee et al., Vyšší úroveň exprese hnRNP A2 / B1 a Hsp90 byly pozorovány v lidském hepatomu HepG2 než v buňkách divokého typu. To vedlo k hledání hlášených funkčních rolí zprostředkovaných společně oběma těmito multifunkčními buněčnými chaperony.[15]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C Alves, P; Arnold, RJ; Novotný, MV; Radivojac, P; Reilly, JP; Tang, H (2007). „Pokrok v odvozování bílkovin z proteomiky brokovnic využívající detekovatelnost peptidů“. Tichomořské symposium o biopočítačích: 409–20. PMID  17990506.
  2. ^ A b Washburn MP, Wolters D, Yates JR (2001). „Rozsáhlá analýza kvasinkového proteomu multidimenzionální technologií identifikace proteinů“. Nat. Biotechnol. 19 (3): 242–247. doi:10.1038/85686. PMID  11231557. S2CID  16796135.
  3. ^ Wolters DA, Washburn MP, Yates JR (2001). "Automatizovaná multidimenzionální technologie identifikace proteinů pro brokovnici proteomiku". Anální. Chem. 73 (23): 5683–5690. doi:10.1021 / ac010617e. PMID  11774908.
  4. ^ A b Hu L, Ye M, Jiang X, Feng S, Zou H (2007). "Pokroky v dělených analytických technikách pro analýzu proteomu brokovnice a peptidomu - přehled". Anální. Chim. Acta. 598 (2): 193–204. doi:10.1016 / j.aca.2007.07.046. PMID  17719892.
  5. ^ A b Fournier ML, Gilmore JM, Martin-Brown SA, Washburn MP (2007). "Vícerozměrná separace založená na brokovnicové proteomice". Chem. Rev. 107 (8): 3654–86. doi:10.1021 / cr068279a. PMID  17649983.
  6. ^ Nesvizhskii AI (2007). Msgstr "Identifikace proteinu pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie a prohledávání databáze sekvencí". Analýza dat hmotnostní spektrometrie v proteomice. Methods Mol. Biol. 367. str. 87–119. doi:10.1385/1-59745-275-0:87. ISBN  978-1-59745-275-5. PMID  17185772.
  7. ^ O'Farrell, PH (25. května 1975). „Dvojrozměrná elektroforéza proteinů s vysokým rozlišením“. The Journal of Biological Chemistry. 250 (10): 4007–21. PMC  2874754. PMID  236308.
  8. ^ Klose, J (1975). „Mapování proteinů kombinovanou izoelektrickou fokusací a elektroforézou myších tkání. Nový přístup k testování indukovaných bodových mutací u savců“. Humangenetik. 26 (3): 231–43. doi:10.1007 / bf00281458 (neaktivní 11. 11. 2020). PMID  1093965.CS1 maint: DOI neaktivní od listopadu 2020 (odkaz)
  9. ^ A b C d Wu CC, MacCoss MJ (2002). "Brokovnice proteomika: nástroje pro analýzu složitých biologických systémů". Aktuální názor na molekulární terapii. 4 (3): 242–50. PMID  12139310.
  10. ^ Zhang B, VerBerkmoes NC, Langston MA, Uberbacher E, Hettich RL, Samatova NF (2006). „Detekce rozdílové a korelované exprese proteinů v brokové proteomice bez štítků“. J Proteome Res. 5 (11): 2909–2918. doi:10.1021 / pr0600273. PMID  17081042. S2CID  22254554.
  11. ^ Tolmachev AV, Monroe ME, Purvine SO, Moore RJ, Jaitly N, Adkins JN, Anderson GA, Smith RD (2008). „Charakterizace strategií pro získání spolehlivých identifikací v proteomických měřeních zdola nahoru pomocí hybridních přístrojů FT MS“. Anální. Chem. 80 (22): 8514–8525. doi:10,1021 / ac801376g. PMC  2692492. PMID  18855412.
  12. ^ Eng, Jimmy K .; McCormack, Ashley L .; Yates, John R. (1. listopadu 1994). "Přístup ke korelaci tandemových hmotnostních spektrálních dat peptidů s aminokyselinovými sekvencemi v proteinové databázi". Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11): 976–989. doi:10.1016/1044-0305(94)80016-2. PMID  24226387. S2CID  18413192.
  13. ^ Cerqueira, Fabio R; Ferreira, Ricardo S; Oliveira, Alcione P; Gomes, Andreia P; Ramos, Humberto JO; Graber, Armin; Baumgartner, Christian (1. ledna 2012). „MUMAL: Vícerozměrná analýza v proteomice brokovnic pomocí technik strojového učení“. BMC Genomics. 13: S4. doi:10.1186 / 1471-2164-13-S5-S4. PMC  3477001. PMID  23095859.
  14. ^ Vaisar, Tomáš; Pennathur, Subramaniam; Green, Pattie S .; Gharib, Sina A .; Hoofnagle, Andrew N .; Cheung, Marian C .; Byun, Jaeman; Vuletic, Simona; Kassim, Sean; Singh, Pragya; Chea, Helen; Knopp, Robert H .; Brunzell, John; Geary, Randolph; Chait, Alan; Zhao, Xue-Qiao; Elkon, Keith; Marcovina, Santica; Ridker, Paul; Oram, John F .; Heinecke, Jay W. (1. března 2007). „Proteomika brokovnic implikuje inhibici proteázy a aktivaci komplementu v protizánětlivých vlastnostech HDL“. Journal of Clinical Investigation. 117 (3): 746–756. doi:10.1172 / JCI26206. PMC  1804352. PMID  17332893.
  15. ^ Lee, Chih-Lei; Hsiao, He-Hsuan; Lin, Chia-Wei; Wu, Szu-Pei; Huang, Shiuan-Yi; Wu, Chi-Yue; Wang, Andrew H.-J .; Khoo, Kay-Hooi (1. prosince 2003). „Strategický brokovnicový proteomický přístup pro efektivní konstrukci expresní mapy cílených proteinových rodin v buněčných liniích hepatomu“. Proteomika. 3 (12): 2472–2486. doi:10.1002 / pmic.200300586. PMID  14673797. S2CID  24518852.

Další čtení

externí odkazy