Kofaktorové inženýrství - Cofactor engineering

Kofaktorové inženýrství, podmnožina metabolické inženýrství, je definována jako manipulace s použitím kofaktory v organismu metabolické cesty. V kofaktorovém inženýrství se koncentrace kofaktorů mění, aby se maximalizovaly nebo minimalizovaly metabolické toky. Tento typ inženýrství lze použít k optimalizaci výroby a metabolit produktu nebo ke zvýšení účinnosti a metabolická síť. Použití inženýrství jednobuněčných organismů k výrobě lukrativních chemikálií z levných surovin roste a kofaktorové inženýrství může hrát klíčovou roli při maximalizaci produkce. Tato oblast si v posledním desetiletí získala větší popularitu a má několik praktických aplikací v chemické výrobě, bioinženýrství a farmaceutickém průmyslu.[1]

Kofaktory jsou ne-protein sloučeniny, které se vážou na proteiny a jsou potřebné pro normální proteiny katalytické funkčnost. Kofaktory lze při biologické aktivitě považovat za „pomocné molekuly“ a často ovlivňují funkčnost enzymů. Kofaktory mohou být organické i anorganické sloučeniny. Některé příklady anorganických kofaktorů jsou železo nebo hořčík a některé příklady organických kofaktorů zahrnují ATP nebo koenzym A. Organické kofaktory jsou konkrétněji známé jako koenzymy, a mnoho enzymů vyžaduje přidání koenzymů, aby převzali normální katalytickou funkci v metabolické reakci. Koenzymy se vážou na aktivní místo enzymu, aby podporovaly katalýzu. Inženýrskými kofaktory a koenzymy lze manipulovat s přirozeně se vyskytující metabolickou reakcí, aby se optimalizoval výstup metabolické sítě.[2][3][4]

Společný kofaktor NADH, první objevený.

Pozadí

Kofaktory objevili Arthur Harden a William Young v roce 1906, když zjistili, že míra alkoholové kvašení v nevařené droždí extrakty se zvýšily přidáním vařeného kvasnicového extraktu.[5] Několik let poté, Hans von Euler-Chelpin identifikoval kofaktor ve vařeném extraktu jako NAD+. Další kofaktory, jako např ATP a koenzym A, byly objeveny později ve 20. letech 20. století. Mechanismus kofaktor aktivita byla objevena, když Otto Heinrich Warburg v roce 1936 to určil NAD+ fungoval jako akceptor elektronů. Po těchto počátečních objevech si vědci začali uvědomovat, že manipulace s koncentracemi kofaktorů může být použita jako nástroj pro zlepšení metabolické cesty.[1]

Důležitá skupina organických kofaktory je rodina molekuly označované jako vitamíny. Vitamin B12 (kobalamin) například hraje klíčovou roli v lidském těle, zatímco koenzym B12, jeho derivát, se nachází v metabolismus všech typů buněk v našich tělech. Jeho přítomnost ovlivňuje syntézu a regulaci buněk DNA stejně jako účast na syntéza mastných kyselin a výroba energie. Kofaktory jsou vyžadovány mnoha důležitými metabolické cesty, a je možné, že koncentrace jednoho typu kofaktoru ovlivňují toky mnoha různých cest.

Minerály a kovové ionty, které organismy přijímají stravou, jsou hlavními příklady anorganické kofaktory. Například Zn2+ je zapotřebí na pomoc enzym uhličitá anhydráza jak se převádí oxid uhličitý a vodu do hydrogenuhličitan a protony. Široce uznávaným minerálem, který působí jako kofaktor, je železo, které je nezbytné pro správnou funkci hemoglobin, protein transportující kyslík nacházející se v červené krvinky. Tento příklad zejména zdůrazňuje význam kofaktorů u zvířat metabolismus.

Význam

Kofaktorové inženýrství je významné při manipulaci s metabolické cesty. Metabolická cesta je řada chemických reakcí, ke kterým dochází v organismu. Metabolické inženýrství je předmětem změn toků v metabolické cestě. V metabolickém inženýrství lze metabolickou cestu přímo změnit změnou funkčnosti enzymy účastnící se cesty. Kofaktorové inženýrství nabízí odlišný přístup a některé výhody ke změně metabolické cesty. Místo změny enzymů použitých v cestě lze změnit kofaktory. To může dát metabolickým inženýrům výhodu kvůli určitým vlastnostem kofaktorů a způsobu, jakým je lze upravit.

Metabolické dráhy mohou metaboličtí inženýři použít k vytvoření požadovaného produktu. Úpravou typů použitých kofaktorů a časů jejich použití se může změnit výsledek metabolické sítě. Aby vytvořili větší produkci produktu, mají metaboličtí inženýři schopnost dodávat do sítě jakýkoli kofaktor, který je pro tento konkrétní proces nejvhodnější. To vede k optimalizaci sítí za účelem vyšší produkce požadovaných produktů. Také změna kofaktorů použitých v síti může být důmyslným řešením komplikovaného problému. Síť, která je v buňce přítomna, ale často se nepoužívá, může mít žádoucí produkt. Místo inženýrství zcela nové sady cest k výrobě produktu lze použít kofaktorové inženýrství. Nahrazením enzymů za použití kofaktorů snadno dostupných v buňce již typicky nepoužívaná síť již není omezena na kofaktory a může dojít ke zvýšení produkce.

Kromě úpravy výnosu metabolických sítí může změna kofaktorů použitých v síti snížit provozní náklady při pokusu o vytvoření požadovaného produktu. NADH a NADPH jsou dva extrémně běžné buněčné kofaktory, které se liší pouze přítomností fosfátové skupiny. Tato fosfátová skupina však činí NADPH mnohem méně stabilní než NADH, a proto je nákladnější jej syntetizovat. Je tedy výhodné vyzkoušet použití NADH v některých celulárních sítích, protože je často levnější, snáze dostupné a plní stejný úkol jako NADPH.

Nástroje a procesy

Kofaktorové inženýrství se nejčastěji zabývá manipulací s mikroorganismy jako Saccharomyces cerevisiae a Escherichia coli, a jako takový vyžaduje použití rekombinantní DNA techniky. Tyto techniky využívají malé kruhové segmenty DNA volala plazmidy, které mohou být zavedeny a zabudovány mikroorganismy, jako jsou Escherichia coli. Tyto plazmidy jsou speciálně navrženy v laboratořích, aby se snadno začlenily a ovlivnily expresi různých protein, metabolity a enzymy. Například konkrétní plazmid může způsobit změnu enzymu aminokyselina sekvence, což by mohlo zvýšit jeho afinitu k určitému Podklad.

Mikroorganismy vyžadují pro pěstování médium, které se běžně používá pro kultury Escherichia coli je Luria-Bertani (LB) vývar. Toto médium je často doplněno glukóza a často bude obsahovat další molekuly navržen tak, aby usnadňoval optimální růst kultury. Prekultury pak mohou být pěstovány v třepaných baňkách. Jsou jednoduše zapojeny Erlenmeyerovy baňky které jsou ponechány na orbitální třepačce, která se točí velmi vysoko RPM. Tento proces provzdušňuje kulturu, což je nezbytné pro optimální růst. Jakmile jsou předkultury připraveny, plazmidy potřebné pro specifické experimenty se přidají ke každé kultuře samostatně a poté se každá kultura přenese do bioreaktoru. Bioreaktory jsou systémy, které umožňují kulturám růst v kontrolovaném prostředí. To ponechává zavedené plazmidy jako jedinou nezávislou proměnnou. Požadovaná teplota, pH, koncentrace metabolitů a různé další faktory prostředí mohou být udržovány bioreaktorem zajišťujícím stejné podmínky růstu pro každou kulturu.

Jakmile jsou vzorky ponechány růst v reaktoru po stanovenou dobu, mohou být odstraněny a studovány, aby se zjistilo, zda jsou patrné zamýšlené změny v organismu. Protože kofaktorové inženýrství se nejčastěji zabývá metabolické cesty, tyto organismy jsou často studovány, ale zavádějí specifické tagy fluorescenční metabolity a dokumentování jejich postupu různými cestami. V ostatních případech jsou výsledky zjevnější a snáze pozorovatelné, například s poklesem ethanol produkce droždí níže.[3][4]

Aplikace

Změna kofaktoru enzymu z NADPH na NADH

Biokatalyzátory jsou vyžadovány pro výrobu chirální stavební kameny potřebné ve farmaceutických a jiných chemických látkách používaných společností. Mnoho takových biokatalyzátorů vyžaduje NADPH jako kofaktor. NADPH, kofaktor docela podobný NADH, je dražší a méně stabilní než jeho protějšek NADH. Z těchto důvodů by výrobci upřednostňovali, aby biokatalyzátory, které používají ve svých výrobních linkách, přijímaly NADH před NADPH. Kofaktorové inženýrství bylo v poslední době úspěšné při změně enzymů tak, aby upřednostňovaly NADH jako kofaktor namísto NADPH. V roce 2010 skupina vědců provedla kofaktorové inženýrství na enzym Gre2p, preferující NADPH dehydrogenáza nalezen v Saccharomyces cerevisiae. Gre2p redukuje sloučeninu diketon 2,5-hexandion na chirální stavební bloky (5S) -hydroxy-2-hexanon a (2S, 5S) -hexandiol. Vědci zjistili, že Asn9 (Asparagin, pozice 9) byla důležitá aminokyselina aktivní stránka Gre2p. Konkrétně se Asn9 váže na 3'-hydroxylovou skupinu a 2'-atom kyslíku adenyl ribózy skupina. Přímo mutageneze, vědci vyměnili Asn9 za obě Asp (Kyselina asparagová ) a Glu (Kyselina glutamová ). Tato změna způsobila, že Gre2p měl sníženou závislost na NADPH a zvýšenou afinitu k NADH. To mělo za následek zvýšenou aktivitu Gre2p při použití NADH. Bylo pozorováno, že nahrazení Asn9 Glu mělo větší účinek než změna Asn9 na Asp. Asn obsahuje polární nenabitý postranní řetězec, zatímco Asp i Glu obsahují polární nabitý postranní řetězec. Zvýšený účinek Glu je způsoben extra uhlíkem v jeho postranním řetězci, který ho přibližuje k adenyl ribosové části. To umožňuje silnější vodíkové vazby mezi 2’- a 3’- ribosou hydroxyl skupiny a postranní řetězec karboxyl skupina. Maximální rychlost reakce se zdvojnásobila při použití NADH, když byl Asn9 nahrazen Glu. S těmito výsledky vědci úspěšně navrhli Gre2p tak, aby upřednostňoval NADH před NADPH, a zvýšil rychlost redukce 2,5-hexandionu. To umožní chemickým společnostem snížit své výrobní náklady použitím NADH místo NADPH alespoň pro toto konkrétní snížení.[6]

Změna předvoleb kofaktoru v síti

Alternativním příkladem změny preference enzymu pro kofaktory je změna reakce závislé na NADH na reakce závislé na NADH. V tomto příkladu se samotné enzymy nemění, ale místo toho se vybírají různé enzymy, které provádějí stejnou reakci s použitím jiného kofaktoru. Byla vytvořena umělá cesta 1-butanol z Acetyl-CoA změnou enzymů v metabolické dráze S. elongatus. The Clostridium Je známo, že rod produkuje 1-butanol a poskytuje cestu, kterou lze vložit do S. elongatus. Tato cesta syntetizuje 1-butanol pomocí reverzní β-oxidační dráhy. Enzymy zapojené do této nově vytvořené dráhy byly specifické pro NADH, což bylo problematické pro replikaci dráhy v S. elongatus, protože sinice produkují mnohem více NADPH než NADH.

Výzkumná skupina poté identifikovala enzymy, které využívají NADPH nebo NADPH i NADH podle bioprozkoumávání. Bylo zjištěno, že acetoacetyl-CoA reduktáza (PhaB) je vhodnou náhradou za hydroxymáselnou dehydrogenázu (Hbd). Aby nahradili AdhE2, vědci zjistili, že alkoholová dehydrogenáza závislá na NADP (YqhD) z E. coli je pro tuto cestu účinná. Kromě toho vědci potřebovali dehydrogenázu, která by nahradila kapacitu aldehyddehydrogenázy AdhE2. Bylo shledáno, že CoA-acylační butyraldehyddehydrogenáza (Bldh) z C. saccharoperbutylacetonicum je dobrá. Společně mohou PhaB, Bldh, YqhD nahradit Hbd, respektive AdhE2, aby se změnila preference kofaktorové redukce 3-ketobutyryl-CoA z použití NADH na použití NADPH. Autoři poté zkonstruovali různé kombinace různých enzymů (těch, které se nacházejí v reverzní oxidační cestě a enzymy využívající NADPH) nadměrnou expresí různých genů v kulturách S. elongatus PCC 7942. Za tímto účelem konstruovali plazmidy obsahující geny odpovídající enzymům a spojit je do genomu S. elongates. Po enzymatických testech produkoval kmen sinic exprimujících enzymy využívající NADPH největší množství 1-butanolu (29,9 mg / l), což převyšovalo kmeny, které nesestávaly z enzymů využívajících NADPH, čtyřikrát. Celkově byl 1-butanol produkován v S. elongatus pomocí cesty z jiného organismu. Tato cesta byla upravena tak, aby odpovídala preferovanému redukčnímu kofaktoru pro sinice.[7]

Příklad toho, jak lze použít Cofactor Engineering k vytvoření jedné cesty k ovlivnění jiné.

Úprava toku metabolitů s rovnováhou kofaktorů

V kofaktorovém inženýrství se metabolická dráha mění změnou koncentrací specifických kofaktorů, které se produkují buď v dané dráze, nebo v samostatné dráze. Například hypotetický organismus může mít dvě libovolné dráhy zvané A a B, kde některé enzymy v A i B využívají stejné kofaktory. Pokud vědci chtěli snížit produkci dráhy A, mohli by nejprve zvážit přímé inženýrství enzymů zapojených do A, snad ke snížení konkrétního aktivní stránky afinita k jeho Podklad. V některých případech však může být obtížné připravit enzymy v A z různých důvodů, nebo může být nemožné je připravit bez nebezpečného ovlivnění některé třetí metabolické dráhy C, která využívá stejné enzymy. Jako samostatnou možnost by vědci mohli zvýšit tok B, což může být jednodušší. To by zase mohlo „svázat“ kofaktory potřebné pro A, což by se zpomalilo enzymatická aktivita, snižující výstup v A. Toto je jeden hypotetický příklad toho, jak lze použít kofaktorové inženýrství, ale existuje mnoho dalších jedinečných případů, kdy vědci používají kofaktory jako způsob změny metabolických cest. Hlavní výhodou kofaktorového inženýrství je, že vědci jej mohou použít k úspěšné změně metabolických cest, které je obtížné připravit pomocí běžného metabolického inženýrství. Toho je dosaženo zaměřením na lépe připravené enzymy v samostatných drahách, které používají stejné kofaktory. Protože mnoho kofaktorů je používáno různými enzymy ve více drahách, může být kofaktorové inženýrství účinnou a nákladově efektivní alternativou k současným metodám metabolického inženýrství.[8]

Viz také: Kvasinky ve vinařství

Droždí se běžně používají v pivním a vinařském průmyslu, protože jsou schopni efektivně vyrábět ethanol skrz metabolická cesta kvašení v nepřítomnosti kyslíku. Fermentace vyžaduje enzym glycerol-3-fosfátdehydrogenáza (GPDH), která závisí na kofaktoru NADH. Tato cesta zahrnuje konverzi glukóza na ethanol i glycerol, oba používají NADH jako a kofaktor. Vědci vytvořili inženýrství Saccharomyces cerevisiae k nadprodukci GPDH, který posunul buňky metabolický tok pryč od ethanolu a směrem k glycerolu omezením dostupnosti NADH v části dráhy produkce ethanolu. Opačného efektu bylo dosaženo ovlivněním oddělené dráhy v buňce, Glutamát Syntetická cesta. Inaktivace exprese enzymu glutamát dehydrogenáza, který je NADPH závislá a nadměrná exprese enzymů glutamin syntetáza a glutamát syntetáza, kteří spoléhají na NADH jako kofaktor, posunuli rovnováhu kofaktorů v cestě syntézy glutamátu. Cesta je nyní závislá spíše na NADH než na NADPH, což snižuje dostupnost NADH ve fermentační cestě. To zase způsobuje zvýšenou produkci ethanolu a snižuje se glycerol Výroba. Tato metoda manipulace metabolické toky lze vizualizovat podobně jako na globálních trzích s palivem, kde by zvýšená produkce etanolu pro použití v automobilovém průmyslu snížila jeho dostupnost v potravinářském průmyslu. Výroba většího množství motorů na ethanol by v zásadě mohla vést ke snížení spotřeby zpracovaných sladkostí, které obsahují kukuřičný sirup s vysokým obsahem fruktózy. Toto inženýrství kofaktorů je použitelné v pivním a vinařském průmyslu, protože umožňuje regulaci hladin etanolu v alkoholických nápojích. Pokrok ve vinařském průmyslu způsobil stálé zvyšování obsahu ethanolu, takže zejména vinaři by se zajímali o možnost snížení obsahu ethanolu v některých jejich vínech.[3]

Cyklus kyseliny citronové

Koenzym A (CoA) a acetyl-CoA jsou dva střední metabolity, nejvíce pozoruhodně nalezený v Cyklus kyseliny citronové, kteří se účastní více než 100 různých reakcí v EU metabolismus mikroorganismů. Nedávné experimenty ukázaly, že nad expresí enzym pantothenát kináza a doplnění kyselina pantothenová v dráze biosyntézy CoA umožnily úpravy jak toků CoA, tak acetyl-CoA. Tato zvýšená koncentrace kofaktorů vedla ke zvýšenému toku uhlíku v isoamylacetát syntézou, zvýšit efektivitu výroby isoamylacetátu. Isoamylacetát se průmyslově používá pro umělou příchuť a pro testování účinnosti respirátory. Kromě výroby isoamylacetátu byla manipulace s biosyntézou CoA během pyruvát hydrogenáza reakce také způsobí zvýšení produkce obou sukcinát a lykopen, z nichž každý má příznivé účinky na lidské tělo. Zvýšení koncentrace sukcinátu, které se používá jako a katalyzátor, může vést ke zvýšení rychlosti cyklu kyseliny citronové, a následně i jednotlivce metabolismus. Bylo prokázáno, že zvyšující se koncentrace lykopenu snižují riziko rakovina prostaty. Potenciálních přínosů z opakování takového výkonu kofaktorového inženýrství a jejich úspěšného začlenění do průmyslových postupů je nespočet.[4][9][10]

Výroba papíru

Mnoho důležitých průmyslové enzymy používat kofaktory k katalyzování reakcí. Pomocí kofaktorů k manipulaci metabolické cesty, je možné snížit náklady na materiál, eliminovat kroky ve výrobě, zkrátit výrobní čas, snížit znečištění a zvýšit celkovou efektivitu výroby. Jeden případ, který demonstruje několik těchto výrobních výhod, zahrnuje genetické inženýrství osika stromy. V procesu výroby papíru se musí výrobní závody rozpadnout lignin, biochemická sloučenina, která dodává kmeni stromu tuhost, aby vytvořila buničinu používanou po zbytek produkce. Proces chemického rozvlákňování vyžaduje, aby výrobní závod používal značné množství energie a také mnoho drahých a toxických chemikálií. Skupina genetických inženýrů, skrz kofaktorové inženýrství, geneticky nadřazený osika strom, který produkoval méně ligninu. Tyto geneticky upravené stromy umožnily papírnám snížit jejich náklady, znečištění a výrobní čas.[1][11]

Další příklady

OrganismusCo se změniloCo to znamená
Mycobacterium smegmatisKoenzym F420Mohl by deaktivovat Kofaktor který vede k rezistenci na léky Tuberkulóza[12]
SiniceKofaktor železo-molybdenVýroba plynného vodíku pro energii[13]
Království ArcheaMolybden Nitrogenáza KofaktorZlepšení účinnosti Fixace dusíku[14]
Thermoanaerobacteria mathraniiglycerol dehydrogenázaUdělat Termofilní Bakterie produkují Ethanol Efektivněji [15]

Krátký popis dalších významných příkladů, kde bylo použito kofaktorové inženýrství.

Poznámky

  1. ^ A b C Raab, Michael; Keith Tyro; Gregory Stephanopoulos (2005). "Metabolické inženýrství". Pokroky v biochemickém inženýrství / biotechnologii. 100 (763): 1–17. doi:10.1007 / b136411. PMID  16270654.
  2. ^ Pollak, N; C Dolle; M. Ziegler (2006). „Síla redukovat: pyridinové nukleotidy - malé molekuly s mnoha funkcemi“. Biochemie. 402 (2): 205–218. doi:10.1042 / BJ20061638. PMC  1798440. PMID  17295611.
  3. ^ A b C Heux, Stephanie; Remy Cachon; Sylvie Dequin (2006). „Kofaktorové inženýrství v Saccharomyces cerevisiae: Exprese H2O-tvořící NADH oxidázy a dopad na redoxní metabolismus“. Metabolické inženýrství. 8 (4): 303–314. doi:10.1016 / j.ymben.2005.12.003. PMID  16473032.
  4. ^ A b C Vadali, Ravishankar; George Bennett (duben 2004). „Kofaktorové inženýrství intracelulárního CoA / acetyl-CoA a jeho účinek na redistribuci metabolického toku v Escherichia coli“. Metabolické inženýrství. 6 (2): 133–139. doi:10.1016 / j.ymben.2004.02.001. PMID  15113566.
  5. ^ Arthur Harden a William John Young. „Alkoholický kvas z kvasnicového džusu“. Sborník královské společnosti v Londýně. Série B, obsahující dokumenty biologického charakteru, Sv. 77, č. 519 (12. dubna 1906), str. 405-420 JSTOR
  6. ^ Katzberg, Michael; Nadia Skorupa-Parachin; Marie-Francoise Gorwa-Grauslund; Martin Bertau (2010). „Engineering Cofactor Preference of Ketone Redukující biokatalyzátory: Studie mutageneze na γ-diketon reduktáze z kvasinek Saccharomyces cerevisiae“. International Journal of Molecular Sciences. 11 (4): 1735–1758. doi:10,3390 / ijms11041735. PMC  2871135. PMID  20480039.
  7. ^ Ethan Lan; James Liao. „ATP řídí přímou fotosyntetickou produkci 1-butanolu v sinicích“. Sborník Národní akademie věd. Citováno 11. prosince 2012.
  8. ^ San, Ka-Yiu; George N. Bennett; Susana J. Berrios-Rivera; Ravi V. Vadali; Yea-Tyng Yang; Emily Horton; Fred B. Rudolph; Berna Sariyar; Kimathi Blackwood (duben 2002). „Metabolic Engineering through Cofactor Manipulation and its Effects on Metabolic Flux Redistribution in Escherichia Coli“. Metabolické inženýrství. 4 (2): 182–193. doi:10.1006 / mben.2001.0220. PMID  12009797.[mrtvý odkaz ]
  9. ^ Giovannucci, Edward; Alberto Ascherio; Eric Rimm; Meir Stampfer; Graham Colditz; Walter Willett (květen 1995). "Příjem karotenoidů a retina ve vztahu k riziku rakoviny prostaty". Journal of the National Cancer Institute. 87 (23): 1767–1776. doi:10.1093 / jnci / 87.23.1767. PMID  7473833.
  10. ^ Potera, Carol (prosinec 2005). „Úspěšnější sukcinace“. Perspektivy zdraví a životního prostředí. 113 (12): A832 – A835. doi:10,1289 / ehp.113-a832. PMC  1314946. PMID  16330341.
  11. ^ Horvath, Laszlo; Ilona Peszlen; Perry Peralta; Bohumil Kasal; Laigeng Li (2010). "Mechanické vlastnosti geneticky upraveného mladého osika s upraveným obsahem nebo strukturou ligninu". Věda o dřevě a vláknech. 42.
  12. ^ Bashiri, G; Rehan, AM; Greenwood, DR; Dickson, JM; Baker, EN (2010). "Metabolické inženýrství produkce kofaktoru F420 v Mycobacterium smegmatis". PLOS One. 5 (12): e15803. doi:10.1371 / journal.pone.0015803. PMC  3012119. PMID  21209917.
  13. ^ Masukawa, H; Inoue, K; Sakurai, H; Wolk, CP; Hausinger, RP. (2010). „Místně zaměřená mutageneze aktivního místa dusíkaté kultury kmene Anabaena sp. PCC 7120 ke zvýšení produkce fotobiologického vodíku“. Aplikovaná a environmentální mikrobiologie. 76 (20): 6741–50. doi:10.1128 / aem.01056-10. PMC  2953041. PMID  20709836.
  14. ^ Hernandez, JA; Curatti, L; Aznar, CP; Perova, Z; Britt, RD; Rubio, LM. (2008). „Obchodování s kovy pro fixaci dusíku: NifQ daruje molybden NifEN / NifH pro biosyntézu dusičnanového FeMo-kofaktoru“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 105 (33): 11679–8. doi:10.1073 / pnas.0803576105. PMC  2575292. PMID  18697927.
  15. ^ Yao, S; Mikkelsen, MJ. (2010). "Metabolické inženýrství ke zlepšení produkce ethanolu v Thermoanaerobacter mathranii". Aplikovaná mikrobiologie a biotechnologie. 88 (1): 199–208. doi:10.1007 / s00253-010-2703-3. PMID  20552355.