Válcování kruhových replikací - Rolling circle replication

Replikace postupného kruhu vytváří více kopií jedné kruhové šablony.

Válcování kruhových replikací (RCA) je proces jednosměrný nukleová kyselina replikace, která může rychle syntetizovat více kopií kruhových molekul DNA nebo RNA, jako plazmidy, genomy z bakteriofágy a kruhová RNA genom viroidy. Některé eukaryotické viry také replikují svou DNA nebo RNA prostřednictvím mechanismu klouzavého kruhu.

Jako zjednodušená verze přirozeného valivého kruhu replikace, izotermický Amplifikace DNA byla vyvinuta technika zesílení kružnice. Mechanismus RCA je široce používán v molekulární biologie a biomedicínské nanotechnologie, zejména v oblasti biosenzování (jako metoda zesílení signálu).[1]

Kruhová replikace DNA

Ilustrace replikace postupného kruhu.

Válcování kruh replikace DNA je iniciován iniciátorovým proteinem kódovaným plazmidovou nebo bakteriofágovou DNA, který prořezává jedno vlákno dvouvláknové cirkulární molekuly DNA v místě zvaném dvouřetězcový původ nebo DSO. Iniciátorový protein zůstává navázán na 5 'fosfátový konec drážkovaného řetězce a volný 3' hydroxylový konec je uvolněn, aby sloužil jako primer pro syntézu DNA pomocí DNA polymeráza III. Při použití nepoškozeného řetězce jako šablony probíhá replikace kolem molekuly kruhové DNA, čímž se vytěsňuje proříznuté vlákno jako jednovláknová DNA. Vytěsnění pořezaného vlákna se provádí hostitelem kódovanou helikázou zvanou PcrA (zkratka pro zmenšení kopie plazmidu) za přítomnosti iniciačního proteinu replikace plazmidu.

Pokračující syntéza DNA může produkovat více jednovláknových lineárních kopií původní DNA v kontinuální sérii od hlavy k patě zvané a concatemer. Tyto lineární kopie lze převést na dvouvláknové kruhové molekuly následujícím postupem:

Nejprve iniciátorový protein vytvoří další nick v DNA, aby ukončil syntézu prvního (vedoucího) řetězce. RNA polymeráza a DNA polymeráza III pak replikují DNA s jedním řetězcem (SSO) za vzniku dalšího dvouřetězcového kruhu. DNA polymeráza I odstraní primer a nahradí jej DNA a DNA ligáza spojuje konce a vytváří další molekulu dvouvláknové kruhové DNA.

Stručně řečeno, typická replikace rotujícího kruhu DNA má pět kroků:[2]

  1. Kruhová dsDNA bude „nicked“.
  2. The 3 'konec je podlouhlá s použitím „nepoškozené“ DNA jako hlavního řetězce (templátu); 5 'konec je přemístěn.
  3. Vyměněná DNA je zaostávající vlákno a je tvořena dvouřetězcovou řadou Okazaki fragmenty.
  4. Replikace „nepoškozené“ i vytěsněné ssDNA.
  5. Vysídlená DNA cirkuluje.

Virologie

Replikace virové DNA

Nějaký DNA viry replikovat své genomové informace v hostitelských buňkách pomocí replikace klouzavého kruhu. Například, lidský herpesvirus-6 (HHV-6) (hibv) exprimuje soubor „časných genů“, o nichž se předpokládá, že jsou zapojeny do tohoto procesu.[3] Dlouhý dobyvatelé které jsou následně štěpeny mezi oblastmi pac-1 a pac-2 genomu HHV-6 ribozymy když je zabalen do jednotlivých virionů.[4]

Model pro replikaci pohyblivých kruhů HPV16.

Lidský papilomavirus-16 (HPV-16) je další virus, který využívá postupnou replikaci k produkci potomstva vysokou rychlostí. HPV-16 infikuje lidské epiteliální buňky a má dvouvláknový kruhový genom. Během replikace se v počátku hexamer E1 obalí kolem jednořetězcové DNA a pohybuje se ve směru 3 'až 5'. Při normální obousměrné replikaci se dva replikační proteiny disociují v době kolize, ale v HPV-16 se předpokládá, že hexamer E1 nedisociuje, což vede k nepřetržité replikaci. Předpokládá se, že tento replikační mechanismus HPV může mít fyziologické důsledky pro integraci viru do chromozomu hostitele a konečnou progresi do rakoviny děložního čípku.[5]

Navíc, geminivirus také využívá replikaci kolečkových kruhů jako svůj mechanismus replikace. Je to virus, který je zodpovědný za zničení mnoha hlavních plodin, jako je maniok, bavlna, luštěniny, kukuřice, rajče a okra. Virus má kruhovou jednovláknovou DNA, která se replikuje v hostitelských rostlinných buňkách. Celý proces je iniciován proteinem iniciátoru replikace geminivirů, Rep, který je také zodpovědný za změnu prostředí hostitele tak, aby fungoval jako součást replikačního aparátu. Rep je také nápadně podobný většině ostatních proteinů iniciátoru replikace eubakterií s přítomností motivů I, II a III na N konci. Během replikace klouzavého kruhu je ssDNA geminiviru převedena na dsDNA a Rep je poté připojen k dsDNA v původní sekvenci TAATATTAC. Poté, co se Rep spolu s dalšími replikačními proteiny váže na dsDNA, vytváří kmenovou smyčku, kde je DNA poté štěpena v nanomerní sekvenci, což způsobuje vytěsnění řetězce. Toto přemístění umožňuje replikační vidlici postupovat ve směru 3 'až 5', což nakonec vede k novému řetězci ssDNA a koncatamerickému řetězci DNA.[6]

Bakteriofág T4 replikace DNA meziprodukty zahrnují kruhový a rozvětvený kruhový koncatemerický struktur.[7] Tyto struktury pravděpodobně odrážejí mechanismus replikace valivého kruhu.

Replikace virové RNA

Některé RNA viry a viroidy také replikují svůj genom replikací RNA v kruhu. U viroidů existují dvě alternativní dráhy replikace RNA, které následují členové rodiny Pospivirodae (asymetrická replikace) a Avsunviroidae (symetrická replikace).

Kruhová replikace virové RNA

V rodině Pospiviroidae (PSTVd-like), kruhová plus vlákno RNA je transkribována hostitelskou RNA polymerázou do oligomerních minus řetězců a poté oligomerních plus řetězců.[8] Tato oligomerní plus vlákna jsou štěpena hostitelskou RNázou a ligována hostitelskou RNA ligázou za účelem reformování monomerní plus vláknové kruhové RNA. Tomu se říká asymetrická cesta replikace kružnice. Viroidi v rodině Avsunviroidae (ASBVd-like) replikují svůj genom symetrickou cestou replikace klouzavého kruhu.[9] V této symetrické dráze se nejprve oligomerní minusová vlákna štěpí a ligují za vzniku monomerních minusových řetězců a poté se transkribují na oligomerní plus vlákna. Tato oligomerní plus vlákna jsou poté štěpena a ligována, aby se reformovalo monomerní plus vlákno. Symetrická replikační cesta byla pojmenována, protože vlákna plus i minus jsou vyráběna stejným způsobem.

Štěpení oligomerních řetězců plus a minus je zprostředkováno samoštěpící strukturou ribozymu kladivové hlavy přítomnou v Avsunviroidae, ale taková struktura v Pospiviroidae chybí.[10]

Zesílení kružnice

Molekulární mechanismus zesílení rotujícího kruhu (RCA)

Derivační forma replikace valivého kruhu byla úspěšně použita pro zesílení DNA z velmi malého množství výchozího materiálu.[1] Tato amplifikační technika je pojmenována jako Rolling circle amplification (RCA). Liší se od konvenčních technik amplifikace DNA, jako je polymerázová řetězová reakce (PCR) „RCA je izotermický amplifikace nukleové kyseliny technika, kdy polymeráza kontinuálně přidává jednotlivé nukleotidy k primeru žíhanému k kruhovému templátu, což vede k dlouhé spojovací ssDNA, která obsahuje desítky až stovky tandemových opakování (doplňujících kruhový templát).[11]

K provedení RCA reakce je zapotřebí pět důležitých komponent:

  1. DNA polymeráza
  2. Vhodný pufr, který je kompatibilní s polymerázou.
  3. Krátký primer DNA nebo RNA
  4. Kruhová šablona DNA
  5. Deoxynukleotid trifosfáty (dNTP)
Metody detekce produktu RCA

Polymerázy používané v RCA jsou Phi29, Bst a Vent exoDNA polymeráza pro amplifikaci DNA a T7 RNA polymeráza pro amplifikaci RNA. Vzhledem k tomu, že DNA29 polymeráza Phi29 má nejlepší procesivitu a schopnost vytěsnění vlákna ze všech výše uvedených polymeráz, byla nejčastěji používána v RCA reakcích. Na rozdíl od polymerázové řetězové reakce (PCR) lze RCA provádět při konstantní teplotě (teplota místnosti až 65 ° C) jak ve volném roztoku, tak na povrchu imobilizovaných cílů (amplifikace na pevné fázi).

Reakce DNA RCA zahrnuje obvykle tři kroky:

  1. Kruhová ligace templátu, kterou lze provádět pomocí templátu zprostředkované enzymatické ligace (např. T4 DNA ligáza) nebo ligace bez templátu pomocí speciálních DNA ligáz (tj. CircLigase).
  2. Primer -indukované prodloužení jednořetězcové DNA. K hybridizaci se stejným kruhem lze použít více primerů. Ve výsledku může být zahájeno několik událostí zesílení, které produkují více produktů RCA („Multiprimed RCA“).
  3. Detekce a vizualizace produktu zesílení, které se nejčastěji provádí pomocí fluorescenční detekce, s dNTP konjugovaným s fluoroforem, fluorofor -vázaný komplementární nebo fluorescenčně značený molekulární majáky. Kromě fluorescenčních přístupů Gelová elektroforéza je také široce používán pro detekci produktu RCA.

RCA produkuje lineární zesílení DNA, protože každý kruhový templát roste určitou rychlostí po určitou dobu při dané rychlosti. Pro zvýšení výtěžku a dosažení exponenciální amplifikace, jak to dělá PCR, bylo zkoumáno několik přístupů. Jedním z nich je hyperrozvětvená amplifikace s valivým kruhem neboli HRCA, kde se přidávají a také prodlužují primery, které hybridizují k původním produktům RCA.[12] Tímto způsobem původní RCA vytváří více šablon, které lze zesílit. Další je amplifikace z kruhu na kruh nebo C2CA, kde jsou produkty RCA štěpeny restrikčním enzymem a ligovány do nových kruhových templátů pomocí restrikčního oliga, následované novým kolem RCA s větším množstvím kruhových templátů pro amplifikaci.[13]

Aplikace RCA

ilustrace imuno-RCA

RCA může zesílit jedinou molekulární vazebnou událost více než tisíckrát, takže je zvláště užitečná pro detekci cílů s ultra nízkou četností. RCA reakce lze provádět nejen v prostředích s volným roztokem, ale také na pevném povrchu, jako je sklo, mikro- nebo nano-perličky, mikrotitrační destičky, mikrofluidní zařízení nebo dokonce papírové proužky. Tato funkce z něj činí velmi výkonný nástroj pro zesílení signálů v pevné fázi imunotesty (např., ELISA ). Tímto způsobem se RCA stává vysoce univerzálním nástrojem pro zesílení signálu s širokými aplikacemi v genomice, proteomice, diagnostice a biosenzování.

Immuno-RCA

Immuno-RCA je metoda izotermického zesílení signálu pro detekci a kvantifikaci proteinů s vysokou specificitou a vysokou citlivostí. Tato technika kombinuje dvě pole: RCA, která umožňuje amplifikaci nukleotidů, a imunotest, který používá protilátky specifické pro intracelulární nebo volné biomarkery. Výsledkem je, že imuno-RCA poskytuje specifický zesílený signál (vysoký poměr signál-šum), takže je vhodný pro detekci, kvantifikaci a vizualizaci proteinových markerů s nízkou abundancí v imunotestech v kapalné fázi[14][15] a imunohistochemie.

Immuno-RCA sleduje typickou imunoabsorpční reakci při barvení ELISA nebo imunohistochemickém barvení tkání.[16] Detekční protilátky použité v imuno-RCA reakci jsou modifikovány připojením ssDNA oligonukleotidu na konec těžkých řetězců. Sekce Fab (fragment, vazba antigenu) na detekční protilátce se tedy může stále vázat na specifické antigeny a oligonukleotid může sloužit jako primer RCA reakce.

Typický postup zprostředkovaný protilátkou zprostředkovaný imuno-RCA je následující:

Ilustrace imuno-rca založené na aptameru

1. Detekční protilátka rozpoznává specifický proteický cíl. Tato protilátka je také připojena k oligonukleotidovému primeru.

2. Pokud je přítomna kruhová DNA, je hybridizována a primer se shoduje s komplementární sekvencí kruhové DNA.

3. Komplementární sekvence kruhového templátu DNA je zkopírována stokrát a zůstává připojena k protilátce.

4. Výstup RCA (prodloužená ssDNA) je detekován fluorescenčními sondami pomocí fluorescenčního mikroskopu nebo čtečky mikrodestiček.

Aptamer na bázi imuno-RCA[17]

Kromě protilátky zprostředkovaného imuno-RCA může být ssDNA RCA primer také konjugován na 3 'konec DNA aptameru. Ocas primeru může být amplifikován prostřednictvím amplifikace s postupným kruhem. Produkt lze vizualizovat pomocí označení fluorescenčního reportéru.[18] Proces je znázorněn na obrázku vpravo.

Další aplikace RCA

V oblasti biosenzování byly široce používány různé deriváty RCA. Například RCA se úspěšně používá k detekci existence virové a bakteriální DNA z klinických vzorků,[19][20] což je velmi výhodné pro rychlou diagnostiku infekční choroby. Používá se také jako metoda amplifikace signálu na čipu pro nukleovou kyselinu (pro DNA i RNA) microarray test.[1]

Kromě funkce amplifikace v biosenzovacích aplikacích lze na konstrukci nanostruktur DNA a DNA použít techniku ​​RCA. hydrogely také. Produkty RCA lze také použít jako šablony pro periodické sestavování nanodruhů nebo proteinů, syntézu kovů nanodráty[21] a formování nano ostrovů.[1]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C d Ali, M. Monsur; Li, Feng; Zhang, Zhiqing; Zhang, Kaixiang; Kang, Dong-Ku; Ankrum, James A .; Le, X. Chris; Zhao, Weian (2014). „Posilování kružnice: univerzální nástroj pro chemickou biologii, vědu o materiálech a medicínu“. Recenze chemické společnosti. 43 (10): 3324–41. doi:10.1039 / C3CS60439J. PMID  24643375.
  2. ^ Rolling Circle Amplification (RCA) - Směrem k nové klinické | Vadim V. Demidov | Springer. Springer. 2016. ISBN  9783319422244.
  3. ^ Arbuckle, Jesse (2011). "Molekulární biologie latence lidského herpesviru-6 a integrace telomer". Mikroby a infekce. 13 (8–9): 731–741. doi:10.1016 / j.micinf.2011.03.006. PMC  3130849. PMID  21458587.
  4. ^ Borenstein, Ronen; Frenkel, Niza (2009). „Klonování genomu lidského herpes viru 6A do bakteriálních umělých chromozomů a studium meziproduktů replikace DNA“. Sborník Národní akademie věd. 106 (45): 19138–19143. Bibcode:2009PNAS..10619138B. doi:10.1073 / pnas.0908504106. PMC  2767366. PMID  19858479.
  5. ^ Kusumoto-Matsuo, Rika; Kanda, Tadahito; Kukimoto, Iwao (01.01.2011). „Kruhová replikace DNA lidského papilomaviru typu 16 v extraktech epiteliálních buněk“. Geny do buněk. 16 (1): 23–33. doi:10.1111 / j.1365-2443.2010.01458.x. ISSN  1365-2443. PMID  21059156.
  6. ^ Rizvi, Irum; Choudhury, Nirupam Roy; Tuteja, Narendra (01.02.2015). „Pohledy na funkční charakteristiky geminivirového iniciátorového proteinu replikace klouzavého kruhu a jeho interakce s hostitelskými faktory ovlivňujícími replikaci virové DNA“. Archivy virologie. 160 (2): 375–387. doi:10.1007 / s00705-014-2297-7. ISSN  0304-8608. PMID  25449306.
  7. ^ Bernstein H, Bernstein C (červenec 1973). "Kruhové a rozvětvené kruhové zřetězí jako možné meziprodukty při replikaci bakteriofága T4 DNA". J. Mol. Biol. 77 (3): 355–61. doi:10.1016/0022-2836(73)90443-9. PMID  4580243.
  8. ^ Daros, José-Antonio; Elena, Santiago F .; Flores, Ricardo (červen 2006). „Viroidy: vlákno Ariadny do labyrintu RNA“. Zprávy EMBO. 7 (6): 593–598. doi:10.1038 / sj.embor.7400706. ISSN  1469-221X. PMC  1479586. PMID  16741503.
  9. ^ Tsagris, Efthimia Mina; Martínez de Alba, Ángel Emilio; Gozmanova, Mariyana; Kalantidis, Kriton (01.11.2008). „Viroidy“. Buněčná mikrobiologie. 10 (11): 2168–2179. doi:10.1111 / j.1462-5822.2008.01231.x. ISSN  1462-5822. PMID  18764915.
  10. ^ Flores, Ricardo; Gas, María-Eugenia; Molina-Serrano, Diego; Nohales, María-Ángeles; Carbonell, Alberto; Gago, Selma; De la Peña, Marcos; Daròs, José-Antonio (2009-09-14). „Viroidová replikace: Rolling-Circles, Enzymes and Ribozymes“. Viry. 1 (2): 317–334. doi:10,3390 / v1020317. PMC  3185496. PMID  21994552.
  11. ^ Ali, M. Monsur; Li, Feng; Zhang, Zhiqing; Zhang, Kaixiang; Kang, Dong-Ku; Ankrum, James A .; Le, X. Chris; Zhao, Weian (2014-05-21). „Posilování kružnice: univerzální nástroj pro chemickou biologii, vědu o materiálech a medicínu“. Recenze chemické společnosti. 43 (10): 3324–3341. doi:10.1039 / c3cs60439j. ISSN  1460-4744. PMID  24643375.
  12. ^ Lizardi, Paul M .; Huang, Xiaohua; Zhu, Zhengrong; Bray-Ward, Patricia; Thomas, David C .; Ward, David C. (červenec 1998). "Detekce mutací a počítání jedné molekuly pomocí izotermické amplifikace s postupným kruhem". Genetika přírody. 19 (3): 225–232. doi:10.1038/898. ISSN  1546-1718.
  13. ^ Dahl, Fredrik; Banér, Johan; Gullberg, Mats; Mendel-Hartvig, Maritha; Landegren, Ulf; Nilsson, Mats (2004-03-30). „Zesílení mezi kruhy pro přesnou a citlivou analýzu DNA“. Sborník Národní akademie věd. 101 (13): 4548–4553. doi:10.1073 / pnas.0400834101. ISSN  0027-8424. PMID  15070755.
  14. ^ Schweitzer, Barry; Roberts, Scott; Grimwade, Brian; Shao, Weiping; Wang, Minjuan; Fu, Qin; Shu, vtipkování; Laroche, Isabelle; Zhou, Zhimin (duben 2002). "Multiplexované profilování proteinů na mikročipech pomocí amplifikace s kruhovým kruhem". Přírodní biotechnologie. 20 (4): 359–365. doi:10.1038 / nbt0402-359. ISSN  1087-0156. PMC  2858761. PMID  11923841.
  15. ^ Zhou, Long; Ou, Li-Juan; Chu, Xia; Shen, Guo-Li; Yu, Ru-Qin (2007). „Aptamer-based Rolling Circle Amplification: A Platform for Electrochemical Detection of Protein“. Analytická chemie. 79 (19): 7492–7500. doi:10.1021 / ac071059s. PMID  17722881.
  16. ^ Gusev, Y .; Sparkowski, J .; Raghunathan, A .; Ferguson, H .; Montano, J .; Bogdan, N .; Schweitzer, B .; Wiltshire, S .; Kingsmore, S. F. (červenec 2001). „Kruhová amplifikace: nový přístup ke zvýšení citlivosti pro imunohistochemii a průtokovou cytometrii“. American Journal of Pathology. 159 (1): 63–69. doi:10.1016 / S0002-9440 (10) 61674-4. ISSN  0002-9440. PMC  1850404. PMID  11438455.
  17. ^ Zhao, Weian; Ali, M. Monsur; Brook, Michael A .; Li, Yingfu (2008-08-11). „Rolling Circle Amplification: Applications in Nanotechnology and Biodetection with Functional Nucleic Acids“. Angewandte Chemie International Edition. 47 (34): 6330–6337. doi:10.1002 / anie.200705982. ISSN  1521-3773. PMID  18680110.
  18. ^ Zhou, Long; Ou, Li-Juan; Chu, Xia; Shen, Guo-Li; Yu, Ru-Qin (01.10.2007). „Aptamer-based Rolling Circle Amplification: A Platform for Electrochemical Detection of Protein“. Analytická chemie. 79 (19): 7492–7500. doi:10.1021 / ac071059s. ISSN  0003-2700. PMID  17722881.
  19. ^ Chen, Xiaoyou; Wang, Bin; Yang, Wen; Kong, Fanrong; Li, Chuanyou; Sun, Zhaogang; Jelfs, Peter; Gilbert, Gwendolyn L. (01.05.2014). „Zesílení kruhovým kruhem pro přímou detekci genových mutací rpoB v izolátech Mycobacterium tuberculosis z klinických vzorků“. Journal of Clinical Microbiology. 52 (5): 1540–1548. doi:10.1128 / JCM.00065-14. ISSN  0095-1137. PMC  3993705. PMID  24574296.
  20. ^ Liu, Yang; Guo, Yan-Ling; Jiang, Guang-Lu; Zhou, Shi-Jie; Sun, Qi; Chen, Xi; Chang, Xiu-Jun; Xing, Ai-Ying; Du, Feng-Jiao (04.06.2013). „Aplikace hyperrozvětvené amplifikace s kruhovým kruhem pro přímou detekci Mycobacterium tuberculosis v klinických vzorcích sputa“. PLOS One. 8 (6): e64583. Bibcode:2013PLoSO ... 864583L. doi:10.1371 / journal.pone.0064583. ISSN  1932-6203. PMC  3672175. PMID  23750210.
  21. ^ Guo, Maoxiang; Hernández-Neuta, Iván; Madaboosi, Narayanan; Nilsson, Mats; Wijngaart, Wouter van der (02.02.2018). „Efektivní DNA transmembránových zlatých nanodrátů za pomoci DNA“. Mikrosystémy a nanoinženýrství. 4: 17084. doi:10.1038 / micronano.2017.84. ISSN  2055-7434.

externí odkazy