Minigen - Minigene

A minigen je minimální genový fragment, který obsahuje exon a kontrolní oblasti nezbytné k tomu, aby se gen mohl exprimovat stejným způsobem jako a divoký typ genový fragment. Jedná se o minigen v jeho nejzákladnějším smyslu. Mohou být konstruovány složitější minigeny obsahující více exonů a intron (y). Minigeny poskytují hodnotný nástroj pro hodnocení výzkumníků sestřih vzory oba in vivo a in vitro biochemicky hodnocené experimenty.[1][2] Konkrétně se jako reportér sestřihu používají minigeny vektory (také zvaný zachycování exonů vektory) a působí jako sonda k určení, které faktory jsou důležité při spojování výsledků. Mohou být konstruovány tak, aby testovaly oba způsoby cis-regulační prvky (Účinky RNA) a transregulační prvky (přidružené bílkoviny /spojovací faktory ) ovlivňují genovou expresi.[3]

Modifikovaný spojovací diagram pro spojování minigenu
pre-mRNA sestřihové vzory ukazující konstitutivní exony a introny a vložený fragment. Oranžové čáry ukazují alternativní výsledky sestřihu, jak diktují exonové sekvence a intronové sekvence (žluté a zelené pruhy), které ovlivňují sestřih. Tyto sekvence mohou být zesilovače nebo tlumiče sestřihu, místa vázající proteinový polypyrimidinový trakt nebo jiné prvky.

Dějiny

Minigeny byly poprvé popsány jako somatické sestavení segmentů DNA a sestávaly z oblastí DNA, o nichž je známo, že kódují protein, a z přilehlých oblastí potřebných k expresi proteinu. Termín byl poprvé použit v článku v roce 1977 k popisu klonování dvou minigenů, které byly navrženy k expresi peptidu.[4]

Sestřih RNA byl objeven koncem sedmdesátých let studiem adenovirů, které napadají savce a replikují se v nich. Vědci identifikovali molekuly RNA, které obsahovaly sekvence z nesouvislých částí genomu viru. Tento objev vedl k závěru, že existovaly regulační mechanismy, které ovlivňovaly zralou RNA a geny, které exprimuje.[5] Přirozeně následovalo použití minigenů jako vektoru sestřihu sestřihu k prozkoumání účinků regulace sestřihu RNA a dodnes zůstává hlavním využitím minigenů.

Typy

Aby byl zajištěn dobrý model minigenu, měl by genový fragment obsahovat všechny nezbytné prvky, aby se zajistilo, že vykazuje stejné alternativní sestřih (AS) vzory jako divoký typ gen, tj. délka fragmentu musí zahrnovat všechny upstream a downstream sekvence, které mohou ovlivnit jeho sestřih.[1][2] Proto většina návrhů minigenů začíná důkladně in silico analýza požadavků experimentu před provedením „mokré“ laboratorní práce.[6] S příchodem Bioinformatika a rozšířené používání počítačů, nyní existuje několik dobrých programů pro identifikaci cis-působících kontrolních oblastí, které ovlivňují výsledky sestřihu genu[7][8] a pokročilé programy mohou dokonce uvažovat o sestřihu výsledků v různých typech tkání.[9] Rozdíly v minigenech se obvykle odrážejí v konečné velikosti fragmentu, což je zase odrazem složitosti samotného minigenu. Počet cizích prvků DNA (exon a introny) vložených do konstitutivních exonů a intronů daného fragmentu se liší podle typu experimentu a požadované informace. Může to zahrnovat typický experiment divoký typ minigeny, u nichž se očekává, že při srovnání budou běžně exprimovat geny, proti geneticky upraveným alelické variace které nahrazují gen divokého typu a byly klonovány do stejných hraničních sekvencí jako původní fragment. Tyto typy experimentů pomáhají určit účinek různých mutací na pre-mRNA sestřih.[3]

Konstrukce

Jakmile je vybrán vhodný genomický fragment (krok 1), mohou být vloženy a amplifikovány exony a introny fragmentu spolu s přilehlými konstitutivními exony a introny původního genu PCR. Primery pro PCR lze zvolit tak, aby odcházely “lepivé konce "na 3 'sense a anti-sense vláknech (krok 2). Tyto" lepivé konce "lze snadno začlenit do TOPO vektoru ligací do komerčně dostupného zdroje, který má na sebe již vázanou ligázu při pohledu na začlenění[10] (Krok 3). Následující TOPO vektory mohou být transfektovány do buněk E. coli (krok 4). Po inkubaci může být celková RNA extrahována z bakteriálních kolonií a analyzována pomocí RT-PCR kvantifikovat poměry zahrnutí / vyloučení exonu (krok 5). Minigen může být transfektován do různých typů buněk s různými sestřihovými faktory pro testování trans-působících prvků (krok 6). Exprimované geny nebo proteiny, které kódují, mohou být analyzovány za účelem vyhodnocení sestřihových komponent a jejich účinků pomocí různých metod včetně hybridizace nebo vylučovací chromatografie.[1][2]

Typický cyklus pro konstrukci minigenu.

Použití

Sestřih RNA chyby se odhadují na třetinu genetických chorob.[Citace je zapotřebí ] Rozumět patogeneze a identifikovat potenciální cíle terapeutické intervence u těchto onemocnění, je nezbytné vysvětlit zapojené spojovací prvky.[11] Stanovení kompletní sady komponent zapojených do sestřihu představuje mnoho výzev kvůli množství alternativního sestřihu, ke kterému dochází ve většině lidských genů, a specifičnosti, při které se sestřih provádí in vivo.[2] Spojování se zřetelně provádí od typu buňky k typu buňky a v různých fázích buněčného vývoje. Proto je zásadní, aby každý in vitro nebo jsou potvrzeny bioinformatické předpoklady o regulaci sestřihu in vivo.[12] K objasnění se používají minigeny cis-regulační prvky, transregulační prvky a další regulátory sestřihu předzralé RNA in vivo.[2] Minigeny byly použity ke studiu rozmanité škály genetických chorob kvůli výše uvedenému množství alternativně sestříhaných genů a specificitě a variacím pozorovaným v regulaci sestřihu.[1][2][12] Následují příklady použití minigenu u různých onemocnění. Ačkoli to není vyčerpávající seznam, poskytuje lepší pochopení toho, jak jsou minigeny využívány.

Endokrinní onemocnění

Chyby sestřihu RNA mohou mít drastické účinky na fungování proteinů, včetně hormonů vylučovaných endokrinní systém. Tyto účinky na hormony byly identifikovány jako příčina mnoha endokrinních poruch, včetně patologických stavů souvisejících se štítnou žlázou, křivice, hyperinzulinemická hypoglykemie a vrozená hyperplázie nadledvin.[13] Jedním konkrétním příkladem chyby sestřihu způsobující endokrinní onemocnění, která byla studována pomocí minigenů, je typ nedostatek růstového hormonu nazývaný nedostatek izolovaného růstového hormonu (IGHD), onemocnění, které vede k selhání růstu. IGHD typu II je autozomálně dominantní forma způsobená mutací v intervenující sekvenci (IVS) sousedící s exonem 3 genu kódujícího růstový hormon 1, gen GH-1. Tato mutovaná forma IVS3 způsobuje přeskočení exonu 3 v produktu mRNA. MRNA (-E3) kóduje zkrácenou formu hGH, která poté inhibuje normální sekreci hGH. Minigeny byly použity k určení, že a bodová mutace za přeskočení E3 byla vina v zesilovači spojování intronů (ISE) zabudovaná do IVS3. Kromě toho bylo zjištěno, že funkce ISE je ovlivněna blízkým transponovatelný AC prvek, odhalující, že tato konkrétní chyba sestřihu je způsobena trans-působícím faktorem.[14]

Neurodegenerativní onemocnění

Akumulace tau protein Je spojená s neurodegenerativní onemocnění počítaje v to Alzheimerova choroba a Parkinsonova choroba nemoci i další tauopatie.[15] Izoformy proteinu Tau jsou vytvářeny alternativním sestřihem exonů 2, 3 a 10. Regulace sestřihu tau je specifická pro fázi vývoje, fyziologii a umístění. Chyby v tau sestřihu se mohou vyskytovat jak v exonech, tak v intronech a v závislosti na chybě vedou ke změnám ve struktuře proteinu nebo ztrátě funkce.[16] Agregace těchto abnormálních tau proteinů přímo koreluje s patogenezí a progresí onemocnění. Minigeny používalo několik vědců k pochopení regulačních složek odpovědných za sestřih mRNA genu TAU.[15][16][17]

Rakovina

Rakovina je složité, heterogenní onemocnění, které může být dědičné nebo výsledkem podnětů z prostředí.[18] Minigeny se používají k tomu, aby pomohly onkologům porozumět rolím pre-mRNA sestřih hraje u různých typů rakoviny. Zvláště zajímavé jsou rakovinově specifické genetické mutace, které narušují normální sestřihové události, včetně těch, které ovlivňují spliceosome komponenty a Proteiny vázající RNA jako heterogenní nukleové ribonukleové částice (hnRNP), proteiny bohaté na serin / arginin (SR) a malé ribonukleoproteiny (snRNP).[19][20] Proteiny kódované aberantně sestřiženými pre-mRNA jsou funkčně odlišné a přispívají k charakteristickým anomáliím vykazovaným rakovinnými buňkami, včetně jejich schopnosti proliferovat, napadat a podstupovat angiogenezi a metastázy.[20] Minigeny pomáhají vědcům identifikovat genetické mutace rakoviny, které vedou k chybám sestřihu, a určit následné účinky, které mají tyto chyby sestřihu na genovou expresi.[21] S využitím poznatků získaných ze studií využívajících minigeny navrhli onkologové testy určené k detekci produktů abnormální genové exprese pro diagnostické účely.[22] Navíc možnost použití minigenů jako a imunoterapie proti rakovině je prozkoumáván.[23][24]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C d Stoss, O; Stoilov, P; Hartmann, AM; Nayler, O; Stamm, S (prosinec 1999). „In vivo minigenový přístup k analýze tkáňově specifického sestřihu“. Výzkum mozku. Protokoly pro výzkum mozku. 4 (3): 383–94. doi:10.1016 / s1385-299x (99) 00043-4. PMID  10592349.
  2. ^ A b C d E F Cooper, Thomas A. (prosinec 2005). "Použití minigenových systémů k disekci alternativních spojovacích prvků". Metody. 37 (4): 331–340. doi:10.1016 / j.ymeth.2005.07.015. PMID  16314262.
  3. ^ A b Desviat, LR; Pérez, B; Ugarte, M (2012). "Minigeny pro potvrzení mutací přeskakujících exon". Přeskakování exonu. Methods Mol. Biol. 867. 37–47. doi:10.1007/978-1-61779-767-5_3. ISBN  978-1-61779-766-8. PMID  22454053.
  4. ^ Poonian, MS; McComas, WW; Nussbaum, AL (1977). „Chemická syntéza dvou deoxyribododekanukleotidů pro připojení restrikčních konců k umělému minigenu“. Gen. 1 (5–6): 357–72. doi:10.1016/0378-1119(77)90040-3. PMID  590743.
  5. ^ Clancy, S (2008). "RNA sestřih: introny, exony a spliceosome". Přírodní výchova. 1 (31).
  6. ^ Burge, Christopher. „Burge Lab Software“. Citováno 7. května 2014.
  7. ^ Divina, Petr; Kvitkovičová, Andrea; Buratti, Emanuele; Vorechovsky, Igor (14. ledna 2009). „Ab initio predikce mutací indukované kryptické aktivace místa sestřihu a přeskakování exonu“. European Journal of Human Genetics. 17 (6): 759–765. doi:10.1038 / ejhg.2008.257. PMC  2947103. PMID  19142208.
  8. ^ Grodecká, Lucie; Lockerová, Pavla; Ravčuková, Barbora; Buratti, Emanuele; Baralle, Francisco E .; Dušek, Ladislav; Freiberger, Tomáš; Spilianakis, Charalampos Babis (21. února 2014). „Exonové první nukleotidové mutace v sestřihu: Vyhodnocení nástrojů In Silico Prediction“. PLOS ONE. 9 (2): e89570. Bibcode:2014PLoSO ... 989570G. doi:10.1371 / journal.pone.0089570. PMC  3931810. PMID  24586880.
  9. ^ Barash, Yoseph; Vaquero-Garcia, Jorge; González-Vallinas, Juan; Xiong, Hui; Gao, Weijun; Lee, Leo J .; Frey, Brendan J. (2013). „AVISPA: webový nástroj pro predikci a analýzu alternativních sestřihů“. Genome Biology. 14 (10): R114. doi:10.1186 / gb-2013-14-10-r114. PMC  4014802. PMID  24156756.
  10. ^ „Kroky při výrobě TOPO vektoru“. Humanitní vědy. Citováno 7. května 2014.
  11. ^ Lim, Kian; Huat; Ferraris, Luciana; Filloux, Madeleine E .; Raphael, Benjamin J .; Fairbrother, William G. (2011). „Použití poziční distribuce k identifikaci sestřihových prvků a předpovědi defektů zpracování pre-mRNA v lidských genech“. Sborník Národní akademie věd. 108 (27): 11093–6. Bibcode:2011PNAS..10811093H. doi:10.1073 / pnas.1101135108. PMC  3131313. PMID  21685335.
  12. ^ A b Stamm, Stefane. „Stamms-lab.net“. Archivovány od originál dne 9. prosince 2013. Citováno 26. března 2014.
  13. ^ Rosaria de Miranda, Elizabete (2009). „Dopad variant sestřihu na normální fyziologii a patologické stavy štítné žlázy“. Metabolismus endokrinolu Arq Bras. 53 (6): 709–714. doi:10.1590 / S0004-27302009000600003. PMID  19893912.
  14. ^ Mullis, PE (2010). "Genetika nedostatku izolovaného růstového hormonu". J Clin Res Pediatr Endocrinol. 2 (2): 52–62. doi:10,4274 / jcrpe.v2i2.52. PMC  3014602. PMID  21274339.
  15. ^ A b Kar, Amar; Fushimi, Kazuo; Zhou, Xiaohong; Ray, Payal; Shi, Chen; Chen, Xiaoping; Liu, Zhiren; Chen, She; Wu, Jane Y. (2011). „RNA Helicase p68 (DDX5) reguluje tau exon 10 sestřih modulací struktury kmen-smyčka na 5 'spojovacím místě“. Mol. Buňka. Biol. 31 (9): 1812–1821. doi:10.1128 / MCB.01149-10. PMC  3133221. PMID  21343338.
  16. ^ A b Rodriguez-Martin, Teresa; Karen Anthony; Mariano A. Garcia-Blanco; S. Gary Mansfield; Brian H. Anderton; Jean-Marc Gallo (2009). „Oprava chybného sestřihu tau způsobená mutacemi FTDP-17 MAPT trans-sestřihem spliceosomu zprostředkovanou RNA“. Hum Mol Genet. 18 (17): 3266–3273. doi:10,1093 / hmg / ddp264. PMC  2722988. PMID  19498037.
  17. ^ Anfossi, M; Vuono, R; Maletta, R; Virdee, K; Mirabelli, M; Colao, R; Puccio, G; Bernardi, L; Frangipane, F; Gallo, M; Geracitano, S; Tomaino, C; Curcio, SA; Zannino, G; Lamenza, F; Duyckaerts, C; Spillantini, MG; Losso, MA; Bruni, AC (2011). "Sloučená heterozygotnost 2 nových MAPT mutací v frontotemporální demenci". Stárnutí neurobiolu. 32 (4): 757.e1–757.e11. doi:10.1016 / j.neurobiolaging.2010.12.013. PMID  21295377.
  18. ^ Rajan, P .; Elliott, DJ; Robson, CN; Leung, HY (srpen 2009). „Alternativní sestřih a biologická heterogenita u rakoviny prostaty“. Nat Rev Urol. 6 (8): 454–460. doi:10.1038 / nrurol.2009.125. PMID  19657379.
  19. ^ Adler, AS; McCleland, ML; Yee, S; Yaylaoglu, M; Hussain, S; Cosino, E; Chinony, G; Modrusan, Z; Seshagiri, S; Torres, E; Chopra, VS; Haley, B; Zhang, Z; Blackwood, EM; Singh, M; Junttila, M; Stephan, JP; Liu, J; Pau, G; Fearon, ER; Jiang, Z; Firestein, R (květen 2014). „Integrativní analýza rakoviny tlustého střeva identifikuje základní funkci PRPF6 v růstu nádoru“. Genes Dev. 28 (10): 1068–84. doi:10.1101 / gad.237206.113. PMC  4035536. PMID  24788092.
  20. ^ A b Guo, Rong; Yong Li; Jinying Ning; Dan Sun; Lianjun Lin; Xinmin Liu (2013). „HnRNP A1 / A2 a SF2 / ASF regulují alternativní sestřih interferonového regulačního faktoru 3 a ovlivňují imunomodulační funkce v lidských nemalobuněčných buňkách rakoviny plic“. PLOS ONE. 8 (4): e62729. Bibcode:2013PLoSO ... 862729G. doi:10.1371 / journal.pone.0062729. PMC  3639176. PMID  23658645.
  21. ^ Acedo, Alberto; David J. Sanz; Mercedes Durán; Mar Infante; Lucía Pérez-Cabornero; Cristina Miner; Eladio A Velasco (2012). "Komplexní sestřih funkční analýzy variant DNA genu BRCA2 hybridními minigeny". Výzkum rakoviny prsu. 14 (3): R87. doi:10.1186 / bcr3202. PMC  3446350. PMID  22632462.
  22. ^ Di Giacomo, D .; Gaildrat, P; Abuli, A; Abdat, J; Frébourg, T; Tosi, M; Martins, A (2013). „Funkční analýza velké sady variant BRCA2 exonu 7 zdůrazňuje prediktivní hodnotu skóre hexameru při detekci alterací regulačních prvků exonového sestřihu“. Hučení. Mutat. 34 (11): 1547–57. doi:10,1002 / humu.22428. PMID  23983145.
  23. ^ Daniotti, Jose L .; Aldo A. Vilcaes; Vanina Torres Demichelis; Fernando M. Ruggiero; Macarena Rodriguez-Walker (2013). „Glykosylace glykolipidů u rakoviny: základ pro vývoj nových terapeutických přístupů“. Přední Oncol. 3: 306. doi:10.3389 / fon.2013.00306. PMC  3867695. PMID  24392350.
  24. ^ Aurisicchio, L; Fridman, A; Bagchi, A; Scarselli, E; La Monica, N; Ciliberto, G (leden 2014). „Nové minigenové lešení pro terapeutické vakcíny proti rakovině“. Onkoimunologie. 3 (1): e27529. doi:10,4161 / onci.27529. PMC  4002591. PMID  24790791.

Další čtení

  • „Alternativní pre-mRNA sestřih: Teorie a protokoly“, Stefan Stamm, Chris Smith a Reinhard Lührmann ISBN  978-3527326068
  • „Molecular Diagnostics, Second edition“, Ed. George P. Patrinos a Whilhelm Ansorge ISBN  0123745373
  • „Vakcíny DNA“ editoval Hildegun Ertl ISBN  1461349257
  • „Alternativní sestřih a nemoc (pokrok v molekulární a subcelulární biologii)“ Philippe Jeanteur ISBN  3540344489

externí odkazy