Lanthanidové sondy - Lanthanide probes

Lanthanidové sondy jsou neinvazivní[1] analytický nástroj běžně používané pro biologický a chemikálie aplikace. Lanthanidy jsou kovové ionty, které mají svou energetickou hladinu 4f naplněnou a obecně odkazují na prvky cer na lutetium v periodická tabulka.[2] The fluorescence lanthanoidových solí je slabá, protože absorpce energie kovového iontu je nízká; proto se nejčastěji používají chelátované komplexy lanthanidů.[3] Termín chelátovat pochází z řeckého slova pro „dráp“ a používá se pro pojmenování ligandů, které se připojují ke kovovému iontu se dvěma nebo více donorovými atomy prostřednictvím dativní dluhopisy. Fluorescence je nejintenzivnější, když má kovový iont oxidační stav 3+. Nelze použít všechny kovy lanthanoidů a nejčastější jsou: Sm (III), Eu (III), Tb (III) a Dy (III).[3]

Dějiny

EuFOD, příklad evropského komplexu

Od počátku 30. let je známo, že soli určitých lanthanoidů jsou fluorescenční.[4] Reakce lanthanidových solí s nukleové kyseliny byla diskutována v řadě publikací během 30. a 40. let, kdy se pro fixaci struktur nukleových kyselin používala činidla obsahující lanthan.[3] V roce 1942 komplexy evropské, terbium, a samarium Bylo zjištěno, že při excitaci vykazují neobvyklé luminiscenční vlastnosti UV světlo.[3] Nicméně první barvení o dvacet let později došlo k bakteriálním nátěrům E-coli byly ošetřeny vodnými roztoky komplexu europia, které pod rtuťová lampa osvětlení vypadalo jako jasně červené skvrny.[1] Pozornost sondám lanthanoidu se značně zvýšila v polovině 70. let, kdy finští vědci navrhli polyaminokarboxyláty Eu (III), Sm (III), Tb (III) a Dy (III) jako luminiscenční senzory v časově rozlišených luminiscenčních (TRL) imunotestech.[1] Optimalizace analytických metod od 70. let 20. století pro cheláty lanthanoidů a časově rozlišená luminiscenční mikroskopie (TRLM) vedly k použití lanthanidových sond v mnoha vědeckých, lékařských a komerčních oborech.[1]

Techniky

Existují dvě hlavní techniky stanovení: heterogenní a homogenní. Pokud se v analýze postupně používají dva cheláty lanthanoidů - nazývá se to heterogenní stanovení.[4] První analyt je spojen se specifickým vazebným činidlem na pevném nosiči, jako je a polymer a pak další reakce spojí první špatně luminiscenční komplex lanthanidu s novým lepším.[1][4] Tato zdlouhavá metoda se používá, protože druhá luminiscenční sloučenina by se neváže bez již přítomného prvního analytu. Následující čas vyřešen detekce luminiscenční sondy se středem kovu poskytuje požadovaný signál. Antigeny, steroidy a hormony jsou rutinně testovány heterogenními technikami. Homogenní testy se spoléhají na přímé navázání lanthanoidové značky na organický akceptor.[1]

Uvolnění stavů excitovaných molekul často nastává při emisi světla, která se nazývá fluorescence. Existují dva způsoby měření tohoto vyzařovaného záření: jako funkce frekvence (inverzní k vlnová délka ) nebo čas.[4] Obvykle fluorescenční spektrum ukazuje intenzitu fluorescence při různých vlnových délkách, ale protože lanthanoidy mají relativně dlouhé doby rozpadu fluorescence (v rozmezí od jedné mikrosekundy do jedné milisekundy), je možné zaznamenat emisi fluorescence v různých dobách rozpadu z dané excitační energie při čas nula. Toto se nazývá časově rozlišená fluorescenční spektroskopie.[5]

Mechanismus

Lanthanidy lze použít, protože jejich malá velikost (iontový poloměr ) jim dává možnost nahradit kovové ionty uvnitř proteinový komplex jako vápník nebo nikl. Optické vlastnosti lanthanoidových iontů, jako je Ln (III), vycházejí ze zvláštních vlastností jejich elektronického [Xe] 4fn konfigurace.[4] Tyto konfigurace generují mnoho elektronických úrovní, jejichž počet je dán vztahem [14! / N! (14- n)!], Překládajícím do 3003 energetických úrovní pro Eu (III) a Tb (III).[1]

Energie těchto úrovní jsou dobře definované díky stínění orbitalů 4f vyplněnými dílčími skořápkami 5s a 5p,[4] a nejsou příliš citliví na chemická prostředí, ve kterých jsou lanthanidové ionty vloženy. Přechody 4f-4f uvnitř pláště pokrývají jak viditelný, tak blízký infračervený rozsah.[1] Jsou ostré a snadno rozpoznatelné. Jelikož jsou tyto přechody zakázány paritou, životnost vzrušených stavů je dlouhá, což umožňuje využití času vyřešeného spektroskopie,[4] definitivní přínos pro biologické zkoušky a mikroskopii. Jedinou nevýhodou přechodů f-f jsou jejich slabé síly oscilátoru, které se ve skutečnosti mohou stát výhodou.[1]

Energie absorbovaná organickým receptorem (ligandem) se přenáší do excitovaných stavů Ln (III) a po rychlé vnitřní přeměně na emisní hladinu jsou detekovány ostré emisní pásy pocházející z kovového iontu.[1] Tento jev se nazývá senzibilizace komplexu soustředěného na kov (také označovaný jako anténní efekt) a je poměrně složitý.[4]Cesta migrace energie však prochází dlouhou životností stav tripletů ligandu. Ln (III) ionty jsou dobré zhášeče stavů tripletů, takže fotobělení je podstatně sníženo. Tři typy přechodů pozorovaných u lanthanidových sond jsou: LMCT, 4f-5d a intraconfigurational 4f-4f. První dva se obvykle vyskytují při příliš vysokých energiích, aby byly relevantní pro biologické aplikace.[1][4]

Aplikace

Výzkum rakoviny

Screeningové nástroje pro vývoj nových rakovina terapie jsou celosvětově velmi žádané a často vyžadují stanovení kinetiky enzymů.[1] Vysoká citlivost luminiscence lanthanoidů, zejména časově rozlišené luminiscence, se ukázala jako ideální kandidát pro tento účel. Existuje několik způsobů provedení této analýzy pomocí použití fluorogenních enzymových substrátů, substrátů nesoucích donorové / akceptorové skupiny umožňujících přenos fluorescenční rezonanční energie (FRET) a imunotestů. Například proteiny vázající se na guanin-nukleotid se skládají z několika podjednotek, z nichž jedna zahrnuje ty z Ras podčeleď.[1] Ras GTPasy působí jako binární přepínače přeměnou guadenosintrifosfátu (GTP ) na guadenosindifosfát (HDP ). Luminiscence komplexu Tb (III) s norfloxacinem je citlivá k určení koncentrace fosfátu uvolněného transformací GTP na GDP.[1]

pH sondy

Protonace základních míst v systémech zahrnujících chromofor a luminiscenční kovové centrum vede cestu pro senzory pH.[4] Některé původně navržené systémy byly založeny na derivátech pyridinu, ale nebyly stabilní ve vodě.[1] Byly navrženy robustnější snímače, u nichž je jádro nahrazeno makrocyklus obvykle ložisko fosfinát, karboxylát nebo čtyři amide koordinační skupiny. Bylo pozorováno, že emise luminiscenční sondy lanthanoidu se zvyšují přibližně šestkrát, když se pH roztoku sníží ze šesti na dvě.[1]

Senzor peroxidu vodíku

Peroxid vodíku lze detekovat s vysokou citlivostí pomocí luminiscence lanthanidových sond - avšak pouze při relativně vysokých hodnotách pH. V roce 2002 byl navržen analytický postup založený na lanthanoidu na základě zjištění, že komplex europium s různými tetracykliny váže peroxid vodíku a vytváří luminiscenční komplex.[1]

Odhad velikosti molekul a vzdáleností atomů

FRET v lanthanidových sondách je široce používanou technikou pro měření vzdálenosti mezi dvěma body oddělenými přibližně 15–100 Angstromem.[6] Měření lze provádět za fyziologických podmínek in vitro s geneticky kódovanými barvivy a často také in vivo. Tato technika se opírá o přenos energie závislý na dálce z donorového fluoroforu na akceptorové barvivo. Lanthanidové sondy byly použity ke studiu interakcí DNA-protein (pomocí a terbium chelátový komplex) k měření vzdáleností v DNA komplexech ohnutých proteinem CAP.[6]

Konformace proteinů

K detekci byly použity lanthanidové sondy konformační změny v bílkovinách. Nedávno třepačka draslíku iontový kanál,[6] pomocí této techniky byl měřen napěťově řízený kanál zapojený do nervových impulsů.[7] Někteří vědci také použili luminiscenční rezonanční přenos energie na bázi lanthanoidů (LRET), který je velmi podobný FRET ke studiu konformačních změn v RNA polymeráze po navázání na DNA a iniciaci transkripce u prokaryot. LRET byl také použit ke studiu interakce proteinů dystrofin a aktin ve svalových buňkách. Dystrofin je přítomen ve vnitřní svalové buněčné membráně a předpokládá se, že stabilizuje svalová vlákna vazbou na aktinová vlákna. Byl použit specificky značený dystrofin se značenými monoklonálními protilátkami značenými Tb.[6]

Virologie

Tradiční virus diagnostické postupy jsou nahrazovány citlivými imunotesty s lanthanoidy. Technika založená na časově rozlišené fluorescenci je obecně použitelná a její účinnost byla také testována při stanovení virových antigenů v klinických vzorcích.[6]

Lékařské zobrazování

Hlavní článek: MRI kontrastní látka

Bylo navrženo několik systémů, které kombinují MRI schopnost s lanthanoidovými sondami v duálních testech.[4] Luminiscenční sonda může například sloužit k lokalizaci kontrastní látky MRI.[8] To pomohlo vizualizovat dodávku nukleových kyselin do kultivovaných buněk. Lanthanidy se nepoužívají pro svou fluorescenci, ale pro své magnetické vlastnosti.[8][9]

Biologie - interakce receptor-ligand

Lanthanidové sondy vykazují jedinečné fluorescenční vlastnosti, včetně dlouhé životnosti fluorescence, velkého Stokesova posunu a úzkého emisního píku. Tyto vlastnosti jsou velmi výhodné pro vývoj analytických sond pro interakce receptor-ligand. Bylo vyvinuto mnoho fluorescenčních studií na bázi lanthanoidů GPCR, počítaje v to CXCR1,[10] peptidový receptor rodiny 2 podobný inzulínu,[11] receptor aktivovaný proteázou 2,[12] β2-adrenergní receptor[13] a Receptor C3a.[14]

Instrumentace

Vyzařovaný fotony z excitovaných lanthanidů jsou detekovány vysoce citlivými zařízeními a technikami, jako je detekce jedním fotonem. Pokud je životnost úrovně excitovaného vyzařování dostatečně dlouhá, lze ke zvýšení poměru signálu k šumu použít časově rozlišenou detekci (TRD).[5] Přístrojové vybavení používané k provádění LRET je relativně jednoduché, i když o něco složitější než běžné fluorimetry. Obecnými požadavky jsou pulzní zdroj UV excitace a časově rozlišená detekce.

Lanthanidová sonda 1.jpg

Světelné zdroje, které emitují krátkodobé impulsy, lze rozdělit do následujících kategorií:[3]

Nejdůležitějšími faktory při výběru zdroje pulzního světla jsou doba trvání a intenzita světla.[3] Pulzní lasery pro rozsah 300 až 500 nm nyní ve fluorescenční spektroskopii nahradily zapalovací čepičky. Používají se čtyři obecné typy pulzních laserů: lasery s pulzním buzením, lasery s přepínáním G, lasery s režimem blokování a dutinové lasery. Pulzní dusíkové lasery (337 nm) se často používají jako zdroj excitace v časově rozlišené fluorometrii.[3]

Časem byla fluorometrie vyřešena rychle fotonásobič je jediný praktický detektor s jedním fotonem. Dobré rozlišení jednotlivých fotonů je také výhodou při počítání fotonů z fluorescenčních sond s dlouhým rozpadem, jako jsou cheláty lanthanoidů.[4]

Na trhu jsou dnes k dispozici tyto komerční nástroje: Perkin-Elmer Mikrofiltrační fluorometr LS-2, luminiscenční spektrometr Perkin-Elmer model LS 5 a časově rozlišené LKB-Wallac Fluorometr Model 1230.[3]

Ligandy

Lanthanidové sondy ligandy Aby sondy správně fungovaly, musí splňovat několik chemických požadavků. Jedná se o vlastnosti: rozpustnost ve vodě, velká termodynamická stabilita při fyziologických podmínkách pH, kinetická inertnost a absorpce nad 330 nm, aby se minimalizovala destrukce živých biologických materiálů.[1]

Chelaty, které byly dosud studovány a používány, lze rozdělit do následujících skupin:[3]

  1. Tris cheláty (tři ligandy)
  2. Tetrakis cheláty (čtyři ligandy)
  3. Smíšené komplexy ligandů
  4. Komplexy s neutrálními dárci
  5. Další, například: ftalát, pikrát, a salicylát komplexy.

Účinnost přenos energie z ligandu na iont se stanoví vazba ligand-kov. Přenos energie je účinnější, když je spojen kovalentně než prostřednictvím iontové vazby.[15] Substituenty v ligandu, které jsou dárci elektronů, jako jsou hydroxy, methoxy a methyl skupiny zvyšují fluorescenci.[3] Opačný účinek je vidět, když je připojena skupina přitahující elektrony (například nitro).[3][4] Kromě toho se intenzita fluorescence zvyšuje substitucí fluoru na ligand. Přenos energie na kovový iont se zvyšuje s elektronegativita fluorované skupiny vytváří evropsko-kyslíkovou vazbu kovalentnější povahy. Zvýšené časování aromatickými substituenty nahrazením fenylu naftyl skupiny zvyšuje fluorescenci.[15]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C d E F G h i j k l m n Ó str q r Bünzli, Jean-Claude G. (12. května 2010). "Lanthanidová luminiscence pro biomedicínské analýzy a zobrazování". Chemické recenze. 110 (5): 2729–2755. doi:10.1021 / cr900362e. PMID  20151630.
  2. ^ House, James (2013). Anorganická chemie (2. vyd.). Waltham, MA: Elsevier / Academic Press. ISBN  978-0123851109.
  3. ^ A b C d E F G h i j k Soini, Erkki; Lövgren, Timo; Reimer, Charles B. (leden 1987). „Časově rozlišená fluorescence lanthanidových sond a aplikace v biotechnologiích“. C R C Kritické recenze v analytické chemii. 18 (2): 105–154. doi:10.1080/10408348708542802.
  4. ^ A b C d E F G h i j k l m Bünzli, editoval J.-C.G .; Choppin, G.R. (1989). Lanthanidové sondy v biologických, chemických a vědách o Zemi: teorie a praxe. Amsterdam: Elsevier. ISBN  978-0444881991.CS1 maint: další text: seznam autorů (odkaz)
  5. ^ A b Hemmilä, I .; Laitala, V. (červenec 2005). "Pokrok v lanthanidech jako luminiscenčních sondách". Journal of Fluorescence. 15 (4): 529–542. doi:10.1007 / s10895-005-2826-6. PMID  16167211. S2CID  9978828.
  6. ^ A b C d E Selvin, Paul R. (červen 2002). „Principy a biofyzikální aplikace sond na bázi lanthanidu“. Roční přehled biofyziky a biomolekulární struktury. 31 (1): 275–302. doi:10.1146 / annurev.biophys.31.101101.140927. PMID  11988471.
  7. ^ Turro, C; Fu, PK; Bradley, PM (2003). "Lanthanidové ionty jako luminiscenční sondy proteinů a nukleových kyselin". Kovové ionty v biologických systémech. 40: 323–53. PMID  12723154.
  8. ^ A b Heffern, Marie C .; Matosziuk, Lauren M .; Meade, Thomas J. (23. dubna 2014). „Lanthanidové sondy pro bioreaktivní zobrazování“. Chemické recenze. 114 (8): 4496–4539. doi:10.1021 / cr400477t. PMC  3999228. PMID  24328202.
  9. ^ Aime, Silvio; Fasano, Mauro; Terreno, Enzo (1998). "Cheláty lanthanidu (III) pro NMR biomedicínské aplikace". Recenze chemické společnosti. 27 (1): 19. doi:10.1039 / A827019Z.
  10. ^ Inglese, J .; Samama, P .; Patel, S .; Burbaum, J .; Cévní mozková příhoda, I.L .; Appell, K. C. (1998-02-24). "Interakce chemokinový receptor-ligand měřeny pomocí časově rozlišené fluorescence". Biochemie. 37 (8): 2372–2377. doi:10.1021 / bi972161u. ISSN  0006-2960. PMID  9485384.
  11. ^ Shabanpoor, Fazel; Hughes, Richard A .; Bathgate, Ross A. D .; Zhang, Suode; Scanlon, Denis B .; Lin, Feng; Hossain, Mohammed Akhter; Separovic, Frances; Wade, John D. (červenec 2008). „Syntéza na pevné fázi evropského značeného lidského INSL3 jako nové sondy pro studium interakcí ligand-receptor“. Biokonjugovaná chemie. 19 (7): 1456–1463. doi:10.1021 / bc800127p. ISSN  1520-4812. PMID  18529069.
  12. ^ Hoffman, Justin; Flynn, Andrea N .; Tillu, Dipti V .; Zhang, Zhenyu; Patek, Renata; Price, Theodore J .; Vagner, Josef; Boitano, Scott (2012-10-17). „Lanthanidové značení silného agonisty receptoru-2 aktivovaného proteázou pro časově rozlišenou fluorescenční analýzu“. Biokonjugovaná chemie. 23 (10): 2098–2104. doi:10.1021 / bc300300q. ISSN  1520-4812. PMC  3556274. PMID  22994402.
  13. ^ Martikkala, Eija; Lehmusto, Mirva; Lilja, Minna; Rozwandowicz-Jansen, Anita; Lunden, Jenni; Tomohiro, Takenori; Hänninen, Pekka; Petäjä-Repo, Ulla; Härmä, Harri (2009-09-15). „Buněčný test vazby beta2-adrenergního receptoru na ligand za použití syntetizovaných ligandů značených evropem a časově rozlišené fluorescence“. Analytická biochemie. 392 (2): 103–109. doi:10.1016 / j.ab.2009.05.022. ISSN  1096-0309. PMID  19464246.
  14. ^ Dantas de Araujo, Aline; Wu, Chongyang; Wu, Kai-Chen; Reid, Robert C .; Durek, Thomas; Lim, Junxian; Fairlie, David P. (2017-05-31). „Europium-značený syntetický protein C3a jako nová fluorescenční sonda pro lidský doplněk C3a receptor“ (PDF). Biokonjugovaná chemie. 28 (6): 1669–1676. doi:10.1021 / acs.bioconjchem.7b00132. ISSN  1043-1802. PMID  28562031.
  15. ^ A b Samuel, Amanda P. S .; Xu, Jide; Raymond, Kenneth N. (19. ledna 2009). „Predikce účinných anténních ligandů pro emise Tb (III)“. Anorganická chemie. 48 (2): 687–698. doi:10.1021 / ic801904s. PMID  19138147.