Rekonstrukce rodové sekvence - Ancestral sequence reconstruction - Wikipedia

Rekonstrukce rodové sekvence (ASR) - také známý jako rodový gen/rekonstrukce sekvence/vzkříšení - je technika používaná při studiu molekulární evoluce. V případě enzymů byl tento přístup nazýván paleoenzymologie (Britský: paleoenzymologie). Metoda spočívá v syntéze předků gen a vyjádření příslušného předka protein.^[1] Myšlenku „vzkříšení“ bílkovin navrhli v roce 1963 Pauling a Zuckerkandl.^[2] V osmdesátých a devadesátých letech byla učiněna určitá počáteční úsilí, vedená laboratoří v Steven A. Benner, ukazující potenciál této techniky - techniky, která se začala naplňovat až v postgenomické éře.^[3] Díky zdokonalení algoritmů a lepším technikám sekvenování a syntézy byla metoda na počátku 20. let 20. století dále vyvinuta, aby umožnila vzkříšení větší rozmanitosti a mnohem starodávnějších genů.^[4] Během posledního desetiletí se vzkříšení proteinů předků vyvinulo jako strategie odhalující mechanismy a dynamiku vývoje proteinů.^[5]

Zásady

Ilustrace fylogenetického stromu a toho, jak hraje při vytváření konceptu, jak probíhá ASR.

Algoritmus pro rekonstrukci rodových sekvencí 1,2 a 3 (s odkazem na obrázek výše). Rodovou sekvenci sekvence 1 lze rekonstruovat z B a C, pokud je k dispozici alespoň jedna outgroup, např. D nebo E. Například sekvence B a C se liší v poloze 4, ale protože sekvence D a E mají C v této poloze, sekvence 1 měla s největší pravděpodobností také C. Sekvenci 3 nelze zcela rekonstruovat bez další posloupnosti outgroup (nejistota označená „X“).

Na rozdíl od konvenčních evolučních a biochemických přístupů ke studiu proteinů, tj. Tzv horizontální srovnání příbuzného proteinu homology z různých konců větve strom života; ASR sondy statisticky odvozené rodové proteiny v uzlech stromu - v a vertikální způsobem (viz obrázek vpravo). Tento přístup poskytuje přístup k vlastnostem bílkovin, které mohly přechodně vzniknout v průběhu evolučního času, a nedávno byl použit jako způsob k odvození potenciálu výběrové tlaky které vyústily v dnešní sekvence viděné dnes. ASR se používá k testování příčinné mutace, která vedla k bílkovině neofunkcionalizace po duplikaci nejprve určením, že uvedená mutace byla umístěna mezi předky '5' a '4' na diagramu (pro ilustraci), pomocí funkčních testů.^[6] V oblasti bílkovin biofyzika, ASR byl také použit ke studiu vývoje termodynamické a kinetické krajiny proteinu v průběhu evolučního času, stejně jako dráhy skládání proteinů kombinací mnoha moderních analytických technik, jako je HX / MS.^[7] Tyto druhy poznatků jsou obvykle odvozeny od několika předků rekonstruovaných podél fylogeneze - s odkazem na předchozí analogii studiem uzlů výš a výš (dále a dále zpět v evolučním čase) ve stromu života.^[8]

Většina studií ASR je prováděna in vitro, a odhalily vlastnosti proteinů předků, které se zdají být evolučně žádoucími vlastnostmi - jako je zvýšená termostabilita, katalytická aktivita a katalytická promiskuita. Tato data byla akreditována pro artefakty algoritmů ASR, jakož i pro orientační ilustrace prostředí staré Země - výzkum ASR musí být často doplněn rozsáhlými kontrolami (obvykle alternativními experimenty ASR), aby se zmírnila chyba algoritmu. Ne všechny studované proteiny ASR vykazují tuto takzvanou „převahu předků“.^[9] Rodící se poleevoluční biochemie „byl posílen nedávným nárůstem studií ASR využívajících předky jako způsoby, jak zkoumat tělesnou zdatnost v určitých buněčných kontextech - účinně testovat proteiny předků in vivo.^[8] Kvůli inherentním omezením v těchto druzích studií - především nedostatkem vhodně starých genomů, které by vyhovovaly těmto předkům, malý repertoár dobře kategorizovaných laboratorních modelových systémů a neschopnost napodobit starověká buněčná prostředí; velmi málo studií ASR in vivo byly provedeny. Navzdory výše uvedeným překážkám ukázaly předběžné poznatky o této třídě výzkumu z papíru z roku 2015, které pozorovaly „nadřazenost předků“ in vitro nebyli rekapitulováni in vivo daného proteinu.^[10] ASR představuje jeden z mála mechanismů ke studiu biochemie Precambrian éra života (> 541Ma ) a proto se často používá vpaleogenetika '; skutečně Zuckerandl a Pauling původně zamýšleli, aby ASR bylo výchozím bodem v oboru, který nazvali „paleobiochemie“.

Metodologie

Několik příbuzných homologů požadovaného proteinu je vybráno a srovnáno v a vícenásobné zarovnání sekvence (MSA), a 'fylogenetický strom 'je konstruován se statisticky odvozenými sekvencemi v uzlech větví. Právě tyto sekvence jsou takzvanými „předky“ - proces syntézy odpovídající DNA, její transformace na buňku a produkce proteinu je takzvanou „rekonstrukcí“. Sekvence předků se obvykle počítají pomocí maximální pravděpodobnost, nicméně Bayesian jsou také implementovány metody. Protože předkové jsou odvozeni z fylogeneze, hraje topologie a složení fylogeneze hlavní roli ve výstupních sekvencích ASR. Vzhledem k tomu, že existuje mnoho diskursů a debat o tom, jak konstruovat fylogeneze - například zda jsou či nejsou termofilní bakterie bazální nebo derivátem v bakteriální evoluci - mnoho článků ASR konstruuje několik fylogenezí s odlišnou topologií, a tedy odlišnými sekvencemi ASR. Tyto sekvence jsou poté porovnány a často je exprimováno a studováno několik (~ 10) na fylogenetický uzel. ASR netvrdí, že znovu vytvoří skutečnou sekvenci starodávného proteinu / DNA, ale spíše sekvenci, která bude pravděpodobně podobná té, která byla skutečně v uzlu. To se nepovažuje za nedostatek ASR, protože zapadá doneutrální síť „model evoluce bílkovin, přičemž v evolučních křižovatkách (uzlech) existovala v existující populaci organismů populace genotypicky odlišných, ale fenotypicky podobných proteinových sekvencí. Je tedy možné, že ASR by generovalo jednu ze sekvencí neutrální sítě uzlu, a přestože nemusí představovat genotyp posledního společného předka moderních sekvencí, pravděpodobně představuje fenotyp.^[8] To je podporováno moderním pozorováním, že mnoho mutací v nekatalytickém / funkčním místě proteinu způsobuje malé změny v biofyzikálních vlastnostech. Proto ASR umožňuje zkoumat biofyzikální vlastnosti minulých proteinů a svědčí o starověké genetice.

Metody maximální věrohodnosti (ML) fungují tak, že generují sekvenci, kde se předpokládá, že reziduum v každé poloze bude s největší pravděpodobností zaujímat uvedenou pozici metodou odvození - obvykle se jedná o bodovací matice (podobné těm, které jsou použity v BLASTY nebo MSA) vypočítané z existujících sekvencí. Mezi alternativní metody patří maximální šetrnost (MP), které konstruují sekvenci na základě modelu evoluce sekvence - obvykle myšlenka, že minimální počet změn nukleotidové sekvence představuje nejúčinnější cestu pro vývoj a Occamova břitva je nejpravděpodobnější. MP je často považován za nejméně spolehlivou metodu rekonstrukce, protože prokazatelně zjednodušuje vývoj do takové míry, která není použitelná v miliardovém měřítku. Další metoda zahrnuje zvážení nejistoty reziduí - tzv. Bayesovské metody - tato forma ASR se někdy používá k doplnění metod ML, ale obvykle vytváří nejednoznačné sekvence. V ASR se termín „nejednoznačnost“ vztahuje k pozicím zbytků, kde nelze předpovědět jasnou substituci - často se v těchto případech vytvoří několik sekvencí ASR, které obsahují většinu nejednoznačností a porovnávají se navzájem. ML ASR často potřebuje doplňující experimenty, které naznačují, že odvozené sekvence jsou více než jen konsensy vstupních sekvencí. To je zvláště nutné při pozorování „Nadřazenosti předků“.^[7] V trendu zvyšování termostability je jedním vysvětlením, že ML ASR vytváří konsenzuální sekvenci několika různých paralelních mechanismů vyvinutých tak, aby během fylogeneze propůjčovala termostabilitu menšího proteinu - což vedlo k aditivnímu účinku vedoucímu k „vynikající“ termostabilitě předků.^[11] K rozpuštění této teorie na experiment je často nutné vyjádření konsensuálních sekvencí a paralelní ASR metodami bez ML. Dalším problémem vyvolaným metodami ML je to, že skórovací matice jsou odvozeny z moderních sekvencí a konkrétní frekvence aminokyselin, které jsou dnes vidět, nemusí být stejné jako v Precambrian biologii, což vede ke zkosené inference sekvence. Několik studií se pokusilo zkonstruovat starověké matice skórování pomocí různých metodik a porovnalo výsledné sekvence a biofyzikální vlastnosti jejich proteinu. Zatímco tyto modifikované sekvence vedou k poněkud odlišným sekvencím ASR, zdálo se, že pozorované biofyzikální vlastnosti se neliší od experimentální chyby.^[12] Kvůli „holistické“ povaze ASR a intenzivní složitosti, která vzniká, když vezmeme v úvahu všechny možné zdroje experimentální chyby - experimentální komunita považuje za konečné měření spolehlivosti ASR srovnání několika alternativních rekonstrukcí ASR stejného uzlu a identifikace podobných biofyzikálních vlastností. I když tato metoda nenabízí spolehlivou statistickou, matematickou míru spolehlivosti, staví na základní myšlence použité v ASR, že jednotlivé aminokyselinové substituce nezpůsobují významné změny biofyzikálních vlastností proteinu - nájemce, který musí být dodržen, aby být schopen překonat účinek nejednoznačnosti závěru.^[13]

Kandidáti využívaní pro ASR jsou často vybíráni na základě konkrétní studované vlastnosti zájmu - např. termostabilita.^[9] Výběrem sekvencí z obou konců rozsahu vlastnosti (např. Psychrofilní proteiny a termofilní proteiny), ale v rámci rodina proteinů, ASR lze použít ke zkoumání specifických změn sekvencí, které poskytly pozorovaný biofyzikální účinek - jako jsou stabilizační interakce. Zvažte v diagramu, že pokud sekvence 'A' kóduje protein, který byl optimálně funkční při neutrálním pH a 'D' v kyselých podmínkách, změny sekvence mezi '5' a '2' mohou ilustrovat přesné biofyzikální vysvětlení tohoto rozdílu. Jelikož experimenty ASR mohou extrahovat předky, které jsou pravděpodobně staré miliardy let, existují často desítky, ne-li stovky sekvenčních změn mezi předky samotnými a předky a existujícími sekvencemi - z tohoto důvodu mohou takové evoluční studie sekvenční funkce vyžadovat hodně práce a racionální směr.^[1][6][14]

Vzkříšené proteiny

Existuje mnoho příkladů proteinů předků, které byly výpočetně rekonstruovány, exprimovány v živých buněčných liniích a - v mnoha případech - čištěny a biochemicky studovány. Laboratoř Thornton zejména vzkřísila několik předků hormonální receptory (od přibližně 500 mA)^[15][16][17] a spolupracoval s laboratoří Stevens na vzkříšení starověku V-ATPáza podjednotky^[18] z droždí (800 mA). The Marqusee laboratoř nedávno zveřejnila několik studií týkajících se evoluční biofyzikální historie E-coli Ribonukleáza H1.^[9][19] Některé další příklady jsou vizuální pigmenty předků u obratlovců,^[20] enzymy v kvasnicích, které štěpí cukry (800 Ma);^[21] enzymy v bakterie které poskytují odpor na antibiotika (2 - 3Ga );^[22] ribonukleázy podílející se na trávení přežvýkavců; a alkoholové dehydrogenázy (Adhs) účastnící se kvasinek kvašení (~ 85 mA).^[13]„Věk“ rekonstruované sekvence se určí pomocí a molekulární hodiny modelu a často je jich několik zaměstnáno.^[7][23] Tato technika datování je často kalibrována pomocí geologických časových bodů (jako jsou staré oceánské složky nebo BIF ) a přestože tyto hodiny nabízejí jedinou metodu k odvození velmi starodávného věku bílkovin, mají rozsáhlé chybové rozpětí a jsou odlišné v obraně proti opačným údajům. Za tímto účelem by „věk“ ASR měl být skutečně používán pouze jako orientační prvek a je často zcela překonán pro měření počtu substitucí mezi rodovou a moderní sekvencí (základ, podle kterého se počítají hodiny).^[9] Jak již bylo řečeno, použití hodin umožňuje porovnat pozorovaná biofyzikální data proteinu ASR s geologickým nebo ekologickým prostředím v té době. Například ASR studie bakteriálních EF-Tus (bílkoviny zapojené do překlad, které pravděpodobně podléhají jen zřídka HGT a obvykle vystavovat Tms ~ 2C větší než Tenv ) označují žhavější prekambrickou Zemi, která velmi úzce odpovídá geologickým údajům o teplotách oceánů starověké Země na základě Kyslík-18 izotopové úrovně.^[12] Studie ASR kvasinek Adhs ukazují, že vznik subfunkcionalizováno Adhs pro metabolismus ethanolu (nejen vylučování odpadu) vznikly v době podobné úsvitu masitého ovoce v Kambrijský Období a to před tímto vznikem, Adh sloužil k vylučování ethanolu jako vedlejšího produktu přebytku pyruvát.^[13] Použití hodin také možná naznačuje, že původ života došlo dříve, než první molekulární fosilie naznačují (> 4,1 Ga), ale vzhledem k diskutabilní spolehlivosti molekulárních hodin je třeba tato pozorování provádět opatrně.^[23][24]

Thioredoxin

Jedním z příkladů je rekonstrukce thioredoxin enzymy až z 4 miliard let starých organismů.^[25] Zatímco chemická aktivita těchto rekonstruovaných enzymů byla pozoruhodně podobná moderním enzymům, jejich fyzikální vlastnosti vykazovaly významně zvýšenou tepelnou a kyselou stabilitu. Tyto výsledky byly interpretovány tak, že naznačují, že starověký život se mohl vyvinout v oceánech, které byly mnohem teplejší a kyselější než dnes.^[25]

Význam

Tyto experimenty se zabývají různými důležitými otázkami v evoluční biologii: ano vývoj postupujte po malých krocích nebo velkými skoky; je vývoj reverzibilní; jak to jde složitost rozvíjet se? Ukázalo se, že mírné mutace v aminokyselinové sekvenci hormonálních receptorů určují důležitou změnu v jejich preferencích pro hormony. Tyto změny znamenají obrovské kroky ve vývoji endokrinní systém. Velmi malé změny na molekulární úrovni tedy mohou mít obrovské důsledky. Laboratoř Thornton také dokázala, že evoluce je při studiu nevratná glukokortikoidový receptor. Tento receptor byl změněn sedmi mutacemi v kortizolovém receptoru, ale zvrácení těchto mutací nedalo původní receptor zpět. Naznačující to epistáza hraje hlavní roli v evoluci bílkovin - pozorování, které v kombinaci s pozorováním několika příkladů paralelní evoluce podporuje výše uvedený neutrální síťový model.^[8] Jiné dříve neutrální mutace choval se jako ráčna a provedl nevratné změny receptoru.^[26] Tyto různé experimenty na receptorech ukazují, že během jejich vývoje jsou proteiny značně diferencované, což vysvětluje, jak se může vyvinout složitost. Bližší pohled na různé receptory hormonů předků a na různé hormony ukazuje, že na úrovni interakce mezi jednotlivými aminokyselinovými zbytky a chemickými skupinami hormonů vznikají velmi malými, ale specifickými změnami. Znalosti o těchto změnách mohou například vést k syntéze hormonálních ekvivalentů schopných napodobovat nebo inhibovat působení hormonu, což by mohlo otevírat možnosti nových terapií.

Vzhledem k tomu, že ASR odhalila tendenci k dávné termostabilitě a enzymatické promiskuitě, představuje ASR cenný nástroj pro proteinoví inženýři kteří často po těchto vlastnostech touží (vytvářející efekty někdy větší než aktuální, racionálně vést nástroje).^[11] ASR také slibuje, že „vzkřísí“ fenotipicky podobné „starověké organismy“, což by zase umožnilo evolučním biochemikům zkoumat příběh života. Zastánci ASR, jako je Benner, uvádějí, že prostřednictvím těchto a dalších experimentů bude na konci současného století dosaženo biologické úrovně porozumění analogické té, která vznikla v klasické chemii v minulém století.^[13]

Viz také

Reference