Pohyb uvázaných částic - Tethered particle motion

Pohyb uvázaných částic (TPM) je biofyzikální metoda, která se používá ke studiu různých polymery jako DNA a jejich interakce s jinými entitami, jako je bílkoviny.

TPM - korálek difunduje v roztoku, ale kvůli uvázání se může pohybovat pouze v omezeném objemu.

Tato metoda umožňuje pozorovatelům měřit různé fyzikální vlastnosti látek a měřit vlastnosti biochemických interakcí s jinými látkami, jako jsou proteiny a enzymy. TPM je experiment s jednou molekulou metoda.

Dějiny

TPM poprvé představili Schafer, Gelles, Sheetz a Landick v roce 1991.^[1] Ve svém výzkumu se připojili RNA polymeráza na povrch a na jeden konec molekul DNA byly připojeny zlaté kuličky. Na začátku RNA polymeráza „zachytí“ DNA poblíž zlatého korálku. Během transkripce "DNA" klouže "na RNA polymerázu, takže se zvětší vzdálenost mezi RNA polymerázou a zlatými perličkami (délka postroje). Pomocí optický mikroskop byla detekována oblast, ve které se korálek pohybuje. Rychlost transkripce byla extrahována z dat.
Od té doby bylo provedeno mnoho experimentů TPM a metoda byla vylepšena mnoha způsoby, jako jsou typy kuliček, techniky biochemie, zobrazování (rychlejší kamery, různé metody mikroskopie atd.), Analýza dat a kombinace s jinými technikami s jednou molekulou ( např. optická nebo magnetická pinzeta).

Princip metody

Jeden konec polymeru je připevněn k malé kuličce (desítky až stovky nanometrů), zatímco druhý konec je připevněn k povrchu. Polymer i kulička zůstávají ve vodném prostředí, takže se kulička pohybuje dovnitř Brownův pohyb. Z důvodu uvázání je pohyb omezen. Pomocí optický mikroskop a CCD kamera, lze sledovat polohu kuliček v časové řadě. I když je korálek obvykle menší než difrakční limit, takže obraz je místo, které je větší než samotný korálek (funkce rozložení bodů ), střed bodu představuje projekci na konec polymeru v rovině X-Y (end-to-end vektor ). Analýza distribuce polohy kuliček nám může říci mnoho informací o polymeru.

Simulace TPM. Simulace provedená uživatelem MATLAB, za použití volně kloubový řetěz model polymery. Zelené body představují projekci end-to-end vektoru polymeru v rovině XY.

Číslo exkurze

Aby pohyb byl ovládán polymerem, a nikoli kuličkám, měli bychom si všimnout, že číslo odchylky, N_R,^[2] bude menší než 1:

{displaystyle N_ {R} equiv {frac {r} {sqrt {Lcdot {l_ {p} / 3}}}} <1}

kde ${displaystyle r}$ je poloměr patky, ${displaystyle L}$ je délka obrysu polymeru a ${displaystyle l_ {p}}$ je délka perzistence (50 nm za fyziologických podmínek) polymeru. (Je možné pracovat, i když ${displaystyle N_ {R}> 1}$ , ale mělo by se s ním zacházet opatrně.)

Typy korálků

Kovové korálky (obvykle zlaté) rozptylují světlo s vysokou intenzitou, takže lze použít velmi malé korálky (průměr ~ 40 nm) a stále mít dobrý obraz. Na druhou stranu kovové korálky nejsou vhodným nástrojem optická pinzeta experimenty.

Polystyrenové kuličky rozptylují světlo slabší než kovové (aby se dosáhlo stejné intenzity jako u zlatého korálku 40 nm, měl by být polystyrenový korálek ~ 125 nm!^[3]), ale má tu výhodu, že jej lze kombinovat s experimenty s optickou pinzetou.

Hlavní výhodou fluorosfér je, že excitace vlnová délka a emisní vlnová délka nejsou stejné, takže dichroický filtr lze použít k poskytnutí čistšího signálu. Nevýhodou fluorosfér je fotobělení.

Všechny typy a průměry perliček (s biochemickým značkovačem, podívejte se na sekci montáže tetheru) jsou vyráběny komerčními společnostmi a lze je snadno zakoupit.

Sestava čipu a postroje

Sestava čipu

Čip může být vyroben ze dvou krycích sklíček. Jeden z nich by měl být vyvrtán, aby se vytvořily dva otvory umožňující vstřikování činidel do průtokové buňky. Sklíčka je třeba vyčistit, aby se odstranily nečistoty. Dobrým nástrojem je lázeňský sonikátor, 15 minut v isopropanolu by mělo stačit. Dále by měl být vytvořen kanál. Jedním ze způsobů, jak toho dosáhnout, je vyříznout parafilm ve středu a ponechat rám parafilmu, který by byl použit jako rozpěrka mezi snímky. Sklíčka by měla být sestavena jeden na druhém s vyříznutým parafilmem mezi nimi. Posledním krokem je zahřátí čipu tak, aby se parafilm roztavil a slepil sklíčka dohromady.

Sestava postroje

Nejprve musí být čip pasivován, aby se polymer nelepil na sklo, je k dispozici spousta blokovacích činidel (BSA, alfa-kasein atd.) A měl by se zjistit, co funguje nejlépe pro konkrétní situaci. povrch by měl být potažen protilátkou nebo jinou reaktivní molekulou (napříkladdigoxigenin ), který se bude vázat na antigen (digoxigenin ) na jednom konci polymeru. Po inkubaci asi 45 minut musí být přebytek protilátky odplaven. Po promytí přebytečné protilátky by měl být polymer nastříknut do čipu a inkubován přibližně stejnou dobu. Polymer byl předtím na koncích modifikován. Jeden konec má biotinový ocas a druhý má digoxigeninový ocas. Po inkubaci musí být nenavázaný polymer z buňky vymyt. Pak anti-biotin potažené kuličky by měly být nastříknuty do flowcell a inkubovány po dobu asi 30-45 minut. Přebytečné kuličky by měly být vypláchnuty.

Analýza dat

Přehrát média

Video pořízené z experimentu TPM pomocí mikroskopu v tmavém poli. Zelené rámované korálky jsou upoutané korálky a červený rám jsou imobilizované korálky.

Sledování

Jak již bylo zmíněno výše, obrázek neukazuje samotný korálek, ale jeho větší místo PSF (Funkce rozložení bodů ). Kromě toho pixel velikost na kameře může snížit rozlišení míry. Aby bylo možné získat přesnou polohu kuliček (která odpovídá vektoru end-to-end), měl by být střed bodu nalezen co nejpřesněji. Toho lze dosáhnout s dobrým rozlišením pomocí dvou různých technik, obě založené na bodových charakteristikách. Intenzita světla v ohnisková rovina distribuováno jako vzdušný disk, a má kruhovou symetrii.

2-dimenzionální Gaussova funkce je dobrá aproximace pro vzdušný disk. Nastavením této funkce na místo lze najít parametry ${displaystyle x_ {0}}$ a ${displaystyle y_ {0}}$ to jsou souřadnice středu bodu a vektoru end-to-end.

Druhou technikou je najít střed intenzity,^[4] pomocí definice těžiště:

{displaystyle {vec {R}} _ {cm} = {frac {1} {I_ {tot}}} cdot součet _ {k = 1} ^ {N} I_ {k} cdot {vec {r}} _ { k}}

kde ${displaystyle {vec {R}} _ {cm}}$ je těžiště souřadnic, ${displaystyle extstyle I_ {tot}}$ je celková intenzita místa a ${displaystyle extstyle I_ {k}}$ a ${displaystyle extstyle {vec {r}} _ {k}}$ jsou intenzita a souřadnice k-tý pixel. Kvůli kruhové symetrii je souřadnice středu intenzity souřadnicí středu perličky.
Obě techniky nám dávají souřadnici end-to-end vektoru v rozlišení lepším než velikost pixelu.

Drift TPM: horní: Zelený graf představuje data experimentu TPM, černá křivka vyhlazuje data (drift). dno: Odečtení posunu od dat.

Korekce driftu

Celý systém se během měření obvykle unáší. Existuje několik metod korekce driftu, které lze obecně rozdělit do 3 skupin:

Brownova pohybová frekvence je mnohem větší než driftová frekvence, takže ji lze použít horní propust za účelem odstranění driftu. Podobného efektu lze dosáhnout vyhlazením dat a odečtením vyhlazených dat (viz obrázek).

Pokud je v rámečku zobrazeno několik korálků, protože každý korálek se pohybuje náhodně, průměrování jejich polohy pro každý snímek by nám mělo dát drift (měl by se odečíst od dat za to, že máme čistá data).

Pokud je v rámečku zobrazena imobilizovaná kulička, můžeme ji vzít jako referenci a data opravit podle polohy imobilizované perličky. (Další výhodou pohledu na imobilizovanou kuličku je skutečnost, že její pohyb nám může říci o přesnosti míry.)
Samozřejmě lze použít více než jednu metodu.

Charakterizace polymeru

Je běžné zapadnout náhodná procházka statistiky k end-to-end vektoru polymeru.^[5] Pro 1-dimenzionální dostaneme Normální distribuce, a pro 2-dimenzionální Rayleighova distribuce:

{displaystyle P_ {1D} (x) dx = {sqrt {frac {3} {4 {pi} Ll_ {p}}}} exp {left (- {frac {3x ^ {2}} {4Ll_ {p}} } ight)} dx ,,,; ,,,,,, P_ {2D} (R) dR = 2 {pi} R {frac {3} {4 {pi} Ll_ {p}}} exp {left (- {frac {3R ^ {2}} {4Ll_ {p}}} ight)} dR}

kde ${displaystyle L}$ je délka obrysu a ${displaystyle l_ {p}}$ je délka perzistence.
Po shromáždění údajů o časových řadách by se mělo přizpůsobit histogram dat do distribuční funkce (jednorozměrné nebo dvourozměrné). Pokud je známa délka obrysu polymeru, je jediným parametrem přizpůsobení délka perzistence.

Jarní konstanta

Kvůli entropická síla, polymer funguje jako Hookian jaro. Podle Boltzmannova distribuce, rozdělení je úměrné exponentu poměru mezi elastická energie a Termální energie:

{displaystyle P (x) propto exp {left (- {frac {{frac {1} {2}} kx ^ {2}} {K_ {B} T}} ight)}}

kde ${displaystyle k}$ je jarní konstanta, ${displaystyle K_ {B}}$ je Boltzmannova konstanta a ${displaystyle T}$ je teplota. Tím, že logaritmus distribuce ${displaystyle P (x)}$ a přizpůsobit to a parabola tvar, lze získat pružinovou konstantu polymeru:^[6]

{displaystyle displaystyle k = 2 {alpha} K_ {B} T}

kde ${displaystyle alpha}$ je koeficient ${displaystyle x ^ {2}}$ z paraboly fit.

Výhoda a nevýhoda

Mezi výhody patří jednoduché nastavení, cena, skutečnost, že pozorování se provádí v přirozeném prostředí polymeru (nepoužívají se žádné vnější síly), je vhodný pro různé metody mikroskopie (např. TIRFM, tmavé pole, kontrastní mikroskopie s rozdílnou interferencí atd.), lze jej kombinovat a manipulovat s ním pomocí jiných metod a existuje celá řada aplikací.^{[Citace je zapotřebí ]} Mezi nevýhody patří nízké prostorové rozlišení (~ 30 nm), ke kterému se hodí in vitro pouze experimenty.^{[Citace je zapotřebí ]}

Viz také

Reference

^ Schafer, D.A., et al., Transkripce jednotlivými molekulami RNA polymerázy pozorovaná světelnou mikroskopií. Nature, 1991. 352: str. 444-448.
^ Segall, D.E .; et al. (2006). „Účinky vylučování objemu v experimentech s upoutanými částicemi: na velikosti kuliček záleží“. Dopisy o fyzické kontrole. 96 (8): 088306. arXiv:q-bio / 0508028. Bibcode:2006PhRvL..96h8306S. doi:10.1103 / PhysRevLett.96.088306. PMC 3261840. PMID 16606235.
^ Paul R. Selvin, Taekjip Ha, Single Molecule Techniques (Kapitola 19)„Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008
^ Blumberg, S., et al., Trojrozměrná charakterizace upoutaných mikrosfér pomocí totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskopie. Biophysical Journal, 2005. 89: str. 1272-1281.^{[mrtvý odkaz ]}
^ Rubinstein, M. & Colby, R.H., Fyzika polymerů (kapitola 2.5 - Distribuce end-to-end vektoru), OXFORD University Press (2003).
^ Dietrich, H.R.C. a kol., Nová optická metoda pro charakterizaci interakcí jedné molekuly založená na mikroskopii tmavého pole. Sborník SPIE, 2007. doi:10.1117/12.699040

[1] Schafer, D.A., et al., Transkripce jednotlivými molekulami RNA polymerázy pozorovaná světelnou mikroskopií. Nature, 1991. 352: str. 444-448.

[2] Segall, D.E .; et al. (2006). „Účinky vylučování objemu v experimentech s upoutanými částicemi: na velikosti kuliček záleží“. Dopisy o fyzické kontrole. 96 (8): 088306. arXiv:q-bio / 0508028. Bibcode:2006PhRvL..96h8306S. doi:10.1103 / PhysRevLett.96.088306. PMC 3261840. PMID 16606235.

[3] Paul R. Selvin, Taekjip Ha, Single Molecule Techniques (Kapitola 19)„Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008

[4] Blumberg, S., et al., Trojrozměrná charakterizace upoutaných mikrosfér pomocí totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskopie. Biophysical Journal, 2005. 89: str. 1272-1281.^{[mrtvý odkaz ]}

[5] Rubinstein, M. & Colby, R.H., Fyzika polymerů (kapitola 2.5 - Distribuce end-to-end vektoru), OXFORD University Press (2003).

[6] Dietrich, H.R.C. a kol., Nová optická metoda pro charakterizaci interakcí jedné molekuly založená na mikroskopii tmavého pole. Sborník SPIE, 2007. doi:10.1117/12.699040

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]