Stabilní značení izotopů aminokyselinami v buněčné kultuře - Stable isotope labeling by amino acids in cell culture

Princip SILAC. Buňky jsou odlišně značeny pěstováním ve světlém médiu s normálním argininem (Arg-0, modrá barva) nebo médiu se silným argininem (Arg-6, červená barva). Metabolická inkorporace aminokyselin do proteinů vede k hromadnému posunu odpovídajících peptidů. Tento hromadný posun lze zjistit pomocí a hmotnostní spektrometr jak je naznačeno zobrazenými hmotnostními spektry. Když jsou oba vzorky kombinovány, poměr intenzit píků v hmotnostním spektru odráží relativní hojnost proteinů. V tomto příkladu má značený protein v obou vzorcích stejné množství (poměr 1).

Stabilní značení izotopů pomocí / s aminokyselinami v buněčné kultuře (SILAC) je technika založená na hmotnostní spektrometrie který detekuje rozdíly v hojnosti bílkovin mezi vzorky pomocí neradioaktivní látky izotopové značení.[1][2][3][4] Je to populární metoda pro kvantitativní proteomika.

Postup

Kultivovány jsou dvě populace buněk buněčná kultura. Jedna z populací buněk je krmena růstové médium obsahující normální aminokyseliny. Naproti tomu je druhá populace krmena růstovým médiem obsahujícím aminokyseliny značené stabilní (neradioaktivní) těžkou látkou izotopy. Například médium může obsahovat arginin označené šesti uhlík-13 atomy (13C) namísto normálu uhlík-12 (12C). Když buňky v tomto médiu rostou, začleňují těžký arginin do všech svých proteinů. Poté jsou všechny peptidy obsahující jeden arginin 6 Da těžší než jejich normální protějšky. Alternativně jednotné označení pomocí 13C nebo 15Lze použít N. Trik spočívá v tom, že proteiny z obou buněčných populací lze kombinovat a analyzovat společně pomocí hmotnostní spektrometrie. Páry chemicky identických peptidů s různým stabilním izotopovým složením lze diferencovat v hmotnostním spektrometru díky jejich hmotnostnímu rozdílu. Poměr špičkových intenzit v hmotnostním spektru pro takové peptidové páry odráží poměr hojnosti pro dva proteiny.[5][3]

Aplikace

Přístup SILAC zahrnující začlenění tyrosin označené devítkou uhlík-13 atomy (13C) namísto normálu uhlík-12 (12C) byl použit ke studiu substrátů tyrosinkinázy v signálních drahách.[6] SILAC se ukázal jako velmi silná metoda studia buněčná signalizace, úpravy po překladu jako fosforylace,[6][7] interakce protein-protein a regulace genové exprese. Kromě toho se SILAC stal důležitou metodou v sekretomika, globální studie vylučované proteiny a sekreční cesty.[8] Lze jej použít k rozlišení mezi proteiny vylučovanými buňkami v kultuře a sérovými kontaminanty.[9] Byly také zveřejněny standardizované protokoly SILAC pro různé aplikace.[10][11]

Zatímco SILAC se většinou používal ke studiu eukaryotických buněk a buněčných kultur, v nedávné době byl používán v bakteriích a jeho mnohobuněčném biofilmu v toleranci vůči antibiotikům, k rozlišení tolerance a citlivých subpopulací.[12]

Pulzní SILAC

Pulzní SILAC (pSILAC) je variace metody SILAC, kdy jsou značené aminokyseliny přidávány do růstového média pouze na krátkou dobu. To umožňuje sledovat rozdíly v de novo produkci bílkovin spíše než surovou koncentraci.[13]

Rovněž byl použit ke studiu tolerance biofilmu k antibiotikům za účelem rozlišení tolerantních a citlivých subpopulací [12]

NeuCode SILAC

Úroveň multiplexování v SILACu byla tradičně omezena kvůli počtu dostupných izotopů SILAC. Nedávno nová technika zvaná NeuCode (kódování neutronů) SILAC zvýšila úroveň multiplexování dosažitelnou pomocí metabolického značení (až 4).[14] Metoda aminokyselin NeuCode je podobná metodě SILAC, ale liší se v tom, že značení využívá pouze těžké aminokyseliny. Použití pouze těžkých aminokyselin eliminuje potřebu 100% inkorporace aminokyselin potřebných pro SILAC. Zvýšená schopnost multiplexování aminokyselin NeuCode je způsobena použitím hromadných defektů z extra neutronů ve stabilních izotopech. Tyto malé hmotnostní rozdíly je však třeba vyřešit na hmotnostních spektrometrech s vysokým rozlišením.

Reference

  1. ^ Oda Y, Huang K, Cross FR, Cowburn D, Chait BT (červen 1999). „Přesné kvantifikace exprese proteinu a místně specifické fosforylace“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (12): 6591–6. Bibcode:1999PNAS ... 96.6591O. doi:10.1073 / pnas.96.12.6591. PMC  21959. PMID  10359756.
  2. ^ Jiang H, anglicky AM (2002). "Kvantitativní analýza kvasinkového proteomu začleněním izotopově značeného leucinu". J. Proteome Res. 1 (4): 345–50. doi:10.1021 / pr025523f. PMID  12645890.
  3. ^ A b Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M (květen 2002). „Stabilní izotopové značení aminokyselinami v buněčné kultuře, SILAC, jako jednoduchý a přesný přístup k proteomice exprese“. Mol. Buňka. Proteomika. 1 (5): 376–86. doi:10,1074 / mcp.M200025-MCP200. PMID  12118079.
  4. ^ Zhu H, Pan S, Gu S, Bradbury EM, Chen X (2002). „Značení stabilního izotopu specifického zbytku aminokyseliny pro kvantitativní proteomiku“. Rapid Commun. Hmotnostní spektrum. 16 (22): 2115–23. Bibcode:2002RCMS ... 16.2115Z. doi:10,1002 / rcm. 831. PMID  12415544.
  5. ^ Schoeters, Floris; Van Dijck, Patrick (2019). „Interakce protein-protein u Candida albicans“. Hranice v mikrobiologii. 10: 1792. doi:10.3389 / fmicb.2019.01792. ISSN  1664-302X. PMC  6693483. PMID  31440220.
  6. ^ A b Ibarrola N, Molina H, Iwahori A, Pandey A (duben 2004). „Nový proteomický přístup ke specifické identifikaci substrátů tyrosinkinázy za použití [13C] tyrosinu“. J. Biol. Chem. 279 (16): 15805–13. doi:10,1074 / jbc.M311714200. PMID  14739304.
  7. ^ Ibarrola N, Kalume DE, Gronborg M, Iwahori A, Pandey A (listopad 2003). „Proteomický přístup ke kvantifikaci fosforylace pomocí stabilního značení izotopů v buněčné kultuře“. Anální. Chem. 75 (22): 6043–9. doi:10.1021 / ac034931f. PMID  14615979.
  8. ^ Hathout Y (duben 2007). "Přístupy ke studiu buněčného sekretomu". Expert Rev Proteomics. 4 (2): 239–48. doi:10.1586/14789450.4.2.239. PMID  17425459. S2CID  26169223.
  9. ^ Poláček, Martin; Bruun, Jack-Ansgar; Johansen, Oddmund; Martinez, Inigo (2010). "Rozdíly v sekretomu chrupavkových explantátů a kultivovaných chondrocytů odhalených technologií SILAC". Journal of Orthopedic Research. 28 (8): 1040–9. doi:10.1002 / jor.21067. PMID  20108312. S2CID  41057768.
  10. ^ Amanchy R, Kalume DE, Pandey A (leden 2005). „Stabilní izotopové značení aminokyselinami v buněčné kultuře (SILAC) pro studium dynamiky hojnosti proteinů a posttranslačních modifikací“. Sci. STKE. 2005 (267): pl2. doi:10.1126 / stke.2672005pl2. PMID  15657263. S2CID  12089034.
  11. ^ Harsha HC, Molina H, Pandey A (2008). „Kvantitativní proteomika využívající stabilní izotopové značení aminokyselinami v buněčné kultuře“. Nat Protoc. 3 (3): 505–16. doi:10.1038 / nprot.2008.2. PMID  18323819. S2CID  24190501.
  12. ^ A b Chua SL, Yam JK, Sze KS, Yang L (2016). „Selektivní značení a eradikace bakteriálních populací tolerantních k antibiotikům v biofilmech Pseudomonas aeruginosa“. Nat Commun. 7: 10750. Bibcode:2016NatCo ... 710750C. doi:10.1038 / ncomms10750. PMC  4762895. PMID  26892159.
  13. ^ Schwanhäusser B, Gossen M, Dittmar G, Selbach M (leden 2009). "Globální analýza translace buněčných proteinů pulzním SILAC". Proteomika. 9 (1): 205–9. doi:10.1002 / pmic.200800275. PMID  19053139. S2CID  23130202.
  14. ^ Merrill AE, Hebert AS, MacGilvray ME, Rose CM, Bailey DJ, Bradley JC, Wood WW, El Masri M, Westphall MS, Gasch AP, Coon JJ (září 2014). "Značky NeuCode pro relativní kvantifikaci proteinů". Mol. Buňka. Proteomika. 13 (9): 2503–12. doi:10,1074 / mcp.M114.040287. PMC  4159665. PMID  24938287.

Další čtení

externí odkazy