Proteomika shora dolů - Top-down proteomics - Wikipedia

Proteomika shora dolů vs. zdola nahoru

Proteomika shora dolů je metoda protein identifikace, která buď používá zachycování iontů hmotnostní spektrometr k uložení izolovaného proteinového iontu pro měření hmotnosti a tandemová hmotnostní spektrometrie (MS / MS) analýza[1][2] nebo jiné metody čištění proteinů, jako je dvourozměrná gelová elektroforéza ve spojení s MS / MS[3]. Vzhůru nohama proteomika je schopen identifikovat a kvantifikovat jedinečné proteoformy prostřednictvím analýzy intaktních proteinů.[4] Název je odvozen od podobného přístupu k sekvenování DNA.[5] Během hmotnostní spektrometrie jsou intaktní proteiny typicky ionizovány pomocí ionizace elektrosprejem a uvězněni v Rezonance iontového cyklotronu s Fourierovou transformací (Penningová past )[6], quadrupole ion trap (Paul trap) nebo Orbitrap hmotnostní spektrometr. Fragmentace pro tandemovou hmotnostní spektrometrii je dosaženo disociace elektronového záchytu nebo disociace elektronového přenosu. Účinná frakcionace je rozhodující pro manipulaci se vzorky před proteomikou založenou na hmotnostní spektrometrii. Proteomová analýza běžně zahrnuje trávení intaktních proteinů a následnou identifikaci odvozeného proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie (SLEČNA).[7] Proteomika shora dolů MS (negelová) vyslýchá proteinovou strukturu měřením intaktní hmoty následovanou přímou disociací iontů v plynné fázi.[8]


Výhody

  • Mezi hlavní výhody přístupu shora dolů patří schopnost detekovat produkty degradace, proteinové izoformy, varianty sekvencí, kombinace posttranslačních modifikací i zjednodušené procesy pro normalizaci a kvantifikaci dat.
  • Proteomika shora dolů, pokud je doprovázena elektroforézou na polyakrylamidovém gelu, může pomoci doplnit proteomický přístup zdola nahoru. Proteomické metody shora dolů mohou pomoci při odhalování velkých odchylek od předpovědí a byly velmi úspěšně sledovány kombinací frakční frakcionace zachycení elektroforézou na bázi gelu s kapalnou frakcí, srážení proteinů a HPLC s reverzní fází s elektrosprejovou ionizací a MS / MS.[9]
  • Charakterizace malých proteinů představuje významnou výzvu pro proteomiku zdola nahoru kvůli neschopnosti generovat dostatečné množství tryptických peptidů pro analýzu. Proteomika shora dolů umožňuje detekci bílkovin s nízkou hmotností, čímž se zvyšuje repertoár známých proteinů.[10] Zatímco Proteomika zdola nahoru integruje štěpené produkty ze všech proteoforem produkovaných genem do jediné peptidové mapy genového produktu plné délky pro tabelaci a kvantifikaci exprimovaných proteinů, hlavní silou proteomiky shora dolů je to, že umožňuje vědcům kvantitativně sledovat jednu nebo více proteoforem z více vzorků a vyříznout tyto proteoformy pro chemickou analýzu.[9]

Nevýhody

  • V nedávné minulosti byl přístup shora dolů přenesen na analýzu jednotlivých proteinů nebo jednoduchých směsí, zatímco komplexní směsi a proteiny byly analyzovány zavedenějšími metodami, jako je proteomika Bottom-up. Navíc identifikace proteinu a charakterizace proteoformy v přístupu TDP (proteomika shora dolů) mohou trpět výzvou dynamického rozsahu, kdy jsou opakovaně fragmentovány stejné vysoce hojné druhy.[4]
  • Ačkoli proteomiku shora dolů lze provozovat v relativně vysokém výkonu, aby bylo možné úspěšně mapovat pokrytí proteomu na velké úrovni, rychlost identifikace nových proteinů po počátečních kolech se poměrně prudce snižuje.[4]
  • Výzkum proteomiky shora dolů může překonat problémy při identifikaci jednotlivých proteinů, ale nebylo jich dosaženo ve velkém měřítku kvůli nedostatku intaktních metod frakcionace proteinů, které jsou integrovány do tandemové hmotnostní spektrometrie.[7]

Výzkum a použití

První studie: Kvantifikace a identifikace tisíců lidských proteinů pod 30 kDa

  • Vědci provedli studii lidských proteoforem pod 30 kDa, použili primární lidské fibroblasty IMR90 obsahující konstrukt funkce Ras, které byly pěstovány v médiu.
  • Rozhodl se použít k charakterizaci těchto proteoformů proteomiku shora dolů, protože je to v současné době nejlepší metoda pro intaktní proteiny, jak jsem již zmínil, Bottom Up digeruje protein a nedělá dobrou práci při poskytování jasného obrazu odlišných intaktních proteoforem.
  • Top Down Proteomics je schopen identifikovat a kvantifikovat jedinečné proteoformy prostřednictvím analýzy intaktních proteinů. Kvantifikace shora dolů přinesla změny v množství 1038 cytoplazmatických proteoform.[4]

Studie dvě: Kombinace vysoce výkonné hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF a izoelektrické fokusační gelové elektroforézy pro virtuální 2D gelovou proteomiku

  • Vědci použili proteomiku shora dolů, protože dokázali identifikovat přesné proteoformy intaktních proteinů, spíše než přístup zdola nahoru, který poskytuje fragmentové ionty peptidů.
  • Tato studie použila Virtual 2D gel spolu s hmotnostní spektrometrií k oddělení proteinových směsí. MALDI je počítačový software, který generuje neporušené hmoty proteinů v každém izoelektrickém bodě. Začalo to obrazem výběru gelu IPG-IEF (izoelektrická fokusace), který byl poté analyzován MALDI.[9]
  • Proteomika shora dolů MALDI-TOF / TOF-MS je tolerantnější vůči nečistotám; nevyžaduje extrakci, čištění a separaci biomarkerů; a lze je přímo aplikovat na intaktní mikroorganismy.[11]

Viz také

Reference

  1. ^ Sze SK, Ge Y, Oh H, McLafferty FW (2002). „Hmotnostní spektrometrie proteinu 29 kDa shora dolů pro charakterizaci jakékoli posttranslační modifikace uvnitř jednoho zbytku“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (4): 1774–9. Bibcode:2002PNAS ... 99.1774S. doi:10.1073 / pnas.251691898. PMC  122269. PMID  11842225.
  2. ^ Kelleher NL (2004). „Proteomika shora dolů“. Anální. Chem. 76 (11): 197A – 203A. doi:10.1021 / ac0415657. PMID  15190879.
  3. ^ Wright EP, Partridge MA, Padula MP, Gauci VJ, Malladi CS, Coorsen JR (2014). „Proteomika shora dolů: Zlepšení 2D gelové elektroforézy od zpracování tkáně po detekci proteinů s vysokou citlivostí“. Proteomika. 14: 872–889. doi:10.1002 / pmic.201300424.
  4. ^ A b C d Durbin, Kenneth Robert; Fornelli, Luca; Fellers, Ryan T .; Doubleday, Peter F .; Narita, Masashi; Kelleher, Neil L. (2016). „Kvantifikace a identifikace tisíců lidských proteinů pod 30 kDa“. Journal of Proteome Research. 15 (3): 976–982. doi:10.1021 / acs.jproteome.5b00997. PMC  4794255. PMID  26795204.
  5. ^ Smith CL, Cantor CR (1989). "Vyvíjející se strategie pro vytváření fyzických map savčích chromozomů". Genom. 31 (2): 1055–8. doi:10,1139 / g89-181. PMID  2698822.
  6. ^ Bogdanov B, Smith RD (2005). „Proteomika hmotnostní spektrometrií FTICR: shora dolů a zdola nahoru“. Recenze hmotnostní spektrometrie. 24 (2): 168–200. Bibcode:2005MSRv ... 24..168B. doi:10.1002 / mas.20015. PMID  15389855.
  7. ^ A b Tran, John C .; Zamdborg, Leonid; Ahlf, Dorothy R .; Lee, Ji Eun; Catherman, Adam D .; Durbin, Kenneth R .; Tipton, Jeremiah D .; Vellaichamy, Adaikkalam; Kellie, John F. (08.12.2011). „Mapování intaktních proteinových izoforem v režimu zjišťování pomocí proteomiky shora dolů“. Příroda. 480 (7376): 254–258. Bibcode:2011 Natur.480..254T. doi:10.1038 / příroda10575. ISSN  0028-0836. PMC  3237778. PMID  22037311.
  8. ^ Parks, Bryan A .; Jiang, Lihua; Thomas, Paul M .; Wenger, Craig D .; Roth, Michael J .; Boyne, Michael T .; Burke, Patricia V .; Kwast, Kurt E .; Kelleher, Neil L. (2007). „Proteomika shora dolů na chromatografické časové škále pomocí hybridních hmotnostních spektrometrů s lineární iontovou pastí Fourierova transformace“. Analytická chemie. 79 (21): 7984–7991. doi:10.1021 / ac070553t. PMC  2361135. PMID  17915963.
  9. ^ A b C Lohnes, Karen; Quebbemann, Neil R .; Liu, Kate; Kobzeff, Fred; Loo, Joseph A .; Ogorzalek Loo, Rachel R. (2016). „Kombinace vysoce výkonné hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF a izoelektrické fokusační gelové elektroforézy pro virtuální 2D gelovou proteomiku“. Metody. 104: 163–169. doi:10.1016 / j.ymeth.2016.01.013. PMC  4930893. PMID  26826592.
  10. ^ Lorenzatto, Karina R .; Kim, Kyunggon; Ntai, Ioanna; Paludo, Gabriela P .; Camargo de Lima, Jeferson; Thomas, Paul M .; Kelleher, Neil L .; Ferreira, Henrique B. (06.11.2015). „Proteomika shora dolů odhaluje zralé proteoformy vyjádřené v subcelulárních frakcích fáze Preadult Echinococcus granulosus“. Journal of Proteome Research. 14 (11): 4805–4814. doi:10.1021 / acs.jproteome.5b00642. ISSN  1535-3907. PMC  4638118. PMID  26465659.
  11. ^ Demirev, Plamen A .; Feldman, Andrew B .; Kowalski, Paul; Lin, Jeffrey S. (2005). "Proteomika shora dolů pro rychlou identifikaci neporušených mikroorganismů". Analytická chemie. 77 (22): 7455–7461. doi:10,1021 / ac051419g. PMID  16285700.

Bibliografie