Izotopově kódovaná afinitní značka - Isotope-coded affinity tag

An Izotopově kódovaná afinitní značka (JÁ KOČKA) je in-vitro izotopové značení metoda použitá pro kvantitativní proteomika podle hmotnostní spektrometrie který používá chemikálie etiketovací činidla.[1][2][3] Tyto chemické sondy se skládají ze tří prvků: reaktivní skupina pro značení aminokyselina postranní řetězec (např. jodacetamid pozměnit cystein zbytky), izotopově kódovaný linker a značka (např. biotin ) pro afinitní izolaci značených proteinů / peptidů. Vzorky jsou spojeny a poté odděleny chromatografií, poté odeslány přes hmotnostní spektrometr pro stanovení poměru hmotnost k náboji mezi proteiny. Lze analyzovat pouze peptidy obsahující cystein. Protože se analyzují pouze peptidy obsahující cystein, často se posttranslační modifikace ztratí.[4]

Rozvoj

Původní značky byly vyvinuty pomocí deuterium, ale později stejná skupina přepracovala značky pomocí 13C místo toho obejít problémy oddělení špiček během kapalinová chromatografie v důsledku interakce deuteria se stacionární fází kolony.[5]

Kvantitativní proteomika

Pro kvantitativní srovnání dvou proteomů je jeden vzorek označen izotopově lehkou (d0) sondou a druhý izotopově těžkou (d8) verzí. Aby se minimalizovala chyba, oba vzorky se poté spojí a digerují se proteáza (tj., trypsin ), a podrobeno avidin afinitní chromatografie izolovat peptidy značené značkovacími činidly kódovanými izotopy. Tyto peptidy jsou poté analyzovány pomocí kapalinová chromatografie - hmotnostní spektrometrie (LC-MS). Poměry signálních intenzit rozdílně hmotnostně značených peptidových párů se kvantifikují, aby se určily relativní hladiny proteinů ve dvou vzorcích.

Reference

  1. ^ Colangelo, Christopher M .; Williams, Kenneth R. (2006). "Značky afinity kódované izotopy pro kvantifikaci proteinů". Nové a vznikající proteomické techniky. Metody v molekulární biologii. 328. str.151–158. doi:10.1385 / 1-59745-026-X: 151. ISBN  978-1-59745-026-3. PMID  16785647.
  2. ^ Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R (říjen 1999). "Kvantitativní analýza komplexních proteinových směsí pomocí izotopově kódovaných afinitních značek". Přírodní biotechnologie. 17 (10): 994–9. doi:10.1038/13690. PMID  10504701.
  3. ^ USA 6670194  „Rychlá kvantitativní analýza proteinů nebo funkce proteinů ve složitých směsích,“ Rudolf Hans Aebersold et al.
  4. ^ "já kočka". Proteomika. Citováno 2020-06-07.
  5. ^ Yi, E.C .; et al. (2005). „Zvýšené kvantitativní pokrytí proteomem s (13) C / (12) C, kyselinou štěpitelným izotopově kódovaným činidlem afinitního tagu a modifikovaným schématem získávání dat“. Proteomika. 5 (2): 380–7. doi:10.1002 / pmic.200400970. PMID  15648049.