Gelová elektroforéza s pulzním polem - Pulsed-field gel electrophoresis

Mikrobiolog provádí test gelové elektroforézy s pulzním polem používaný při bakteriální typizaci

Gelová elektroforéza s pulzním polem je technika používaná k oddělení velkých DNA molekuly podáním žádosti o a gel matice a elektrické pole který pravidelně mění směr.[1][2]

Historické pozadí

Standard Gelová elektroforéza techniky separace molekul DNA poskytly molekulární biologii obrovské výhody. Nebylo však schopno účinně oddělit velmi velké molekuly DNA. Molekuly DNA větší než 15–20 kb migrující přes gel se budou v podstatě pohybovat společně způsobem nezávislým na velikosti. Na Columbia University v roce 1984 David C. Schwartz a Charles Cantor vyvinul variantu standardního protokolu zavedením střídavý gradient napětí ke zlepšení rozlišení větších molekul.[3]Tato technika se stala známou jako gelová elektroforéza s pulzním polem (PFGE). Vývoj PFGE rozšířil rozsah rozlišení fragmentů DNA až o dva řády.

Postup

Klastrová analýza v BioNumerika enteroagregativních kmenů Escherichia coli z otisku prstu gelové elektroforézy s pulzním polem

Postup pro tuto techniku ​​je relativně podobný provedení standardní gelové elektroforézy s tím rozdílem, že místo neustálého chodu napětí v jednom směru se napětí pravidelně přepíná mezi třemi směry; jeden, který prochází středovou osou gelu a dva, které probíhají pod úhlem 60 stupňů po obou stranách. Časy pulzů jsou stejné pro každý směr, což vede k čisté dopředné migraci DNA. Pro extrémně velké molekuly (až do přibližně 2 Mb) lze použít rampy spínacího intervalu, které v průběhu několika hodin zvyšují dobu pulzu pro každý směr - například při lineárním zvýšení pulzu z 10 sekund při 0 hodin až 60 sekund při 18 hodinách.

Tento postup trvá déle než normální gelová elektroforéza kvůli velikosti řešených fragmentů a skutečnosti, že DNA se nepohybuje v přímém směru skrz gel.

Teorie

Zatímco obecně malé fragmenty mohou najít cestu gelovou matricí snadněji než velké fragmenty DNA, existuje prahová délka nad 30–50 kb, kde budou všechny velké fragmenty probíhat stejnou rychlostí a budou vypadat v gelu jako jediná velká difúzní kapela.

S periodickou změnou směru pole však různé délky DNA reagují na změnu různými rychlostmi. To znamená, že větší části DNA budou při změně směru pole pomaleji rekonfigurovat svůj náboj, zatímco menší části budou rychlejší. V průběhu času s důslednou změnou směrů se každé pásmo začne oddělovat stále více a to i při velmi velkých délkách. Tím je umožněna separace velmi velkých kousků DNA pomocí PFGE.

Aplikace

PFGE lze použít pro genotypizace nebo genetické otisky prstů. Běžně se to považuje za Zlatý standard v epidemiologické studie patogenních organismů. Subtypování usnadnilo rozlišování mezi kmeny Listeria monocytogenes a tím spojit izoláty prostředí nebo potravin s klinickými infekcemi.

Viz také

Reference

  1. ^ Kaufmann, Mary Elizabeth (1998). „Gelová elektroforéza s pulzním polem“. Molekulární bakteriologie. Metody v molekulární medicíně. 15. str. 33–50. doi:10.1385/0-89603-498-4:33. ISBN  0-89603-498-4. PMID  21390741.
  2. ^ Herschleb, Jill; Ananiev, Gene; Schwartz, David C (2007). "Gelová elektroforéza s pulzním polem". Přírodní protokoly. 2 (3): 677–684. doi:10.1038 / nprot.2007.94. ISSN  1750-2799. PMID  17406630.
  3. ^ Schwartz DC, Cantor CR (květen 1984). "Separace DNA o velikosti kvasinkových chromozomů pomocí pulzní gelové gradientové gelové elektroforézy". Buňka. 37 (1): 67–75. doi:10.1016/0092-8674(84)90301-5. PMID  6373014.

externí odkazy