Diferenční gelová elektroforéza - Difference gel electrophoresis

Diferenční gelová elektroforéza (DIGE) je forma Gelová elektroforéza kde až tři různé protein vzorky mohou být označeny spektrálně rozlišitelným, shodným s velikostí náboje fluorescenční barviva (například Cy3, Cy5, Cy2) před dvourozměrná gelová elektroforéza.[1]

Postup

Tyto tři vzorky jsou smíchány a naneseny na IEF (isolektrická fokusační chromatografie) pro první rozměr a proužek je přenesen na SDS PAGE. Po gelové elektroforéze je gel skenován pomocí excitační vlnová délka každého barviva jeden po druhém, takže každý vzorek lze vidět samostatně (pokud skenujeme gel na excitační vlnová délka barviva Cy3 uvidíme v gelu pouze vzorek, který byl tímto barvivem označen). Tato technika se používá k vidění změn v nadbytku bílkovin (například mezi vzorkem zdravého člověka a vzorkem osoby s onemocněním), posttranslační úpravy, zkrácení a jakékoli úpravy, které by mohly změnit velikost nebo izoelektrický bod proteinů . Binární posuny mohou být zleva doprava (změna v izoelektrickém bodě), vertikální (změna ve velikosti) nebo úhlopříčka (změna ve velikosti i izoelektrickém bodě). Reciproční značení se provádí, aby se zajistilo, že pozorované změny nejsou způsobeny interakcemi závislými na barvivu.

Výhody

Překonává omezení v tradiční 2D elektroforéze, která jsou způsobena variací mezi gely. To může být značné iu identických vzorků. Vzhledem k tomu, že proteiny z různých typů vzorků (např. Zdravé / nemocné, virulentní / nevirulentní) běží na stejném gelu, lze je přímo porovnat. Provedení tradiční 2D elektroforézou vyžaduje velké množství časově náročných opakování.

Standardy

V experimentech zahrnujících několik gelů je běžnou technikou zahrnutí vnitřního standardu do každého gelu. Vnitřní standard se připraví smícháním několika nebo všech vzorků v experimentu. To umožňuje měření množství proteinu v každém vzorku vzhledem k vnitřnímu standardu. Jelikož je známo, že množství každého proteinu ve vnitřním standardu jsou stejná v každém gelu, snižuje tato metoda mezigelové variace. Elektroforéza zahrnující sloučený vnitřní standard.[2]

Viz také

Reference

  1. ^ Unlü M, Morgan ME, Minden JS. Diferenční gelová elektroforéza: jediná gelová metoda pro detekci změn v proteinových extraktech. Elektroforéza. Říjen 1997; 18 (11): 2071-7. PMID 9420172
  2. ^ Alban, Andrew; David, Stephen Olu; Bjorkesten, Lennart; Andersson, Christian; Sloge, Erik; Lewis, Steve; Currie, Ian (2003). „Nový experimentální design pro komparativní dvourozměrnou gelovou analýzu: Dvourozměrná diferenční gelová elektroforéza zahrnující sdružený vnitřní standard“. Proteomika. 3 (1): 36–44. doi:10.1002 / pmic.200390006. ISSN  1615-9853. PMID  12548632.