ChIL-sekvenování - ChIL-sequencing

Sekvenování ChIL (ChIL-seq), také známý jako Sekvenování značení integrace chromatinu, je metoda používaná k analýze protein interakce s DNA. ChIL-sekvenování kombinuje řízené štěpení cílené na protilátky Tn5 transpozáza s masivně paralelní Sekvenování DNA identifikovat vazebná místa proteinů asociovaných s DNA. Může být použit k mapování globálních DNA vazebných míst přesně pro jakýkoli požadovaný protein. V současné době, ChIP-sekv je nejběžnější technikou používanou ke studiu vztahů protein - DNA, nicméně trpí řadou praktických a ekonomických omezení, která ChIL-Sequencing ne. ChIL-Seq je přesná technika, která snižuje ztrátu vzorku, kterou lze aplikovat na jednotlivé buňky. [1]

Použití

ChIL-sekvenování lze použít k vyšetření genové regulace nebo k analýze transkripční faktor a další vazba na protein spojená s chromatinem. Interakce protein-DNA regulují genová exprese a jsou odpovědné za mnoho biologických procesů a chorobných stavů. Tento epigenetický informace doplňují genotyp a analýza výrazu. ChIL-Seq je alternativou k současnému standardu ChIP-sekv. ChIP-Seq trpí omezeními kvůli kroku zesíťování v protokolech ChIP-Seq, které mohou podporovat maskování epitopů a generovat falešně pozitivní vazebná místa.[2][3] ChIP-seq také trpí suboptimálními poměry signálu k šumu a špatným rozlišením.[4] Sekvence ChIL má tu výhodu, že je jednodušší technikou vhodnou pro nízký vstup vzorku kvůli vysokému poměru signálu k šumu, což vyžaduje menší hloubku sekvenování pro vyšší citlivost.[5]

Specifická místa DNA v přímé fyzické interakci s proteiny, jako jsou transkripční faktory, lze izolovat pomocí Protein-A (pA) konjugovaný Tn5 vázán na sledovaný protein. Štěpení zprostředkované Tn5 produkuje knihovnu cílových míst DNA navázaných na požadovaný protein in situ. Sekvenování připravených knihoven DNA a srovnání s databázemi sekvencí celého genomu umožňuje vědcům analyzovat interakce mezi cílovými proteiny a DNA, stejně jako rozdíly v epigenetice chromatin modifikace. Proto může být metoda ChIL-Se použita na proteiny a modifikace, včetně transkripční faktory, polymerázy, strukturní proteiny, modifikace proteinů a modifikace DNA.

Protokoly

V úložišti metod s otevřeným přístupem jsou k dispozici podrobné pracovní postupy ChIL-Seq.[6]

Omezení

Primárním omezením ChIL-seq je pravděpodobnost nadměrného trávení DNA v důsledku nevhodného načasování reakce Tn5 závislé na hořčíku. To je předpojaté vůči otevřenému chromatinu ATAC sekvence a podobné techniky.[5] Podobné omezení existuje pro současné protokoly ChIP-Seq, kde musí být optimalizováno enzymatické nebo sonikované stříhání DNA. Stejně jako u ChIP-sekv je vyžadována kvalitní protilátka cílená na požadovaný protein.

ChIL-Seq vyžaduje četné laboratorní kroky a trvá déle než u jiných technik, jako je CUT & RUN nebo CUT & Tag. Stále se jedná o široce použitelnou techniku, která zabrání ztrátě vzorku vhodná pro malý počet buněk. Náklady na spotřební materiál ChIL-Seq jsou však podstatně nižší, což umožňuje zpracování více vzorků. [7]

Podobné metody

  • Sono-Seq: Totožné s ChIP-Seq, ale bez kroku imunoprecipitace.
  • HITS-CLIP: Také zvaný CLIP-sekv, používané k detekci interakcí s RNA spíše než DNA.
  • PAR-CLIP: Metoda pro identifikaci vazebných míst buněk Proteiny vázající RNA.
  • RIP čip: Podobně jako ChIP-Seq, ale nepoužívá metody síťového propojení a využívá microarray analýza místo sekvenování.
  • SELEX: Zaměstnáno k určení konsensuálních vazebných sekvencí.
  • Soutěžní čip: Měří relativní dynamiku náhrady na DNA.
  • ChiRP-sekv: Měří DNA a proteiny vázané na RNA.
  • ChIP-exo: Využívá zpracování exonukleázou k dosažení rozlišení až jednoho páru bazí
  • ChIP-nexus: Potenciální zlepšení na ChIP-exo, schopný dosáhnout až rozlišení jednoho páru bází.
  • DRIP-seq: Používá protilátku S9.6 k vysrážení třířetězcových hybridů DND: RNA R-smyčky.
  • TCP-seq: Principiálně podobná metoda měření dynamiky translace mRNA.
  • POŠKOZENO: Používá obohacení methylovaných sekvencí DNA k detekci interakce protein-DNA bez protilátek.

Viz také

Reference

  1. ^ „Když méně je více: slibný přístup k epigenomickému profilování s nízkým počtem buněk“. Věda denně. 11. prosince 2018. Citováno 24. prosince 2019.
  2. ^ Meyer CA, Liu XS (listopad 2014). „Identifikace a zmírnění zkreslení v metodách sekvenování příští generace pro biologii chromatinu“. Recenze přírody. Genetika. 15 (11): 709–21. doi:10.1038 / nrg3788. PMC  4473780. PMID  25223782.
  3. ^ Baranello L, Kouzine F, Sanford S, Levens D (květen 2016). "Předpětí ChIP jako funkce doby síťování". Chromozomový výzkum. 24 (2): 175–81. doi:10.1007 / s10577-015-9509-1. PMC  4860130. PMID  26685864.
  4. ^ He C, Bonasio R (únor 2017). „Řez výše“. eLife. 6. doi:10,7554 / eLife.25000. PMC  5310838. PMID  28199181.
  5. ^ A b Harada A, Maehara K, Handa T, Arimura Y, Nogami J, Hayashi-Takanawa Y, Shirahige K, Kurumizaka H, ​​Kimura H, Ohkawa Y (prosinec 2018). "Metoda značení integrace chromatinu umožňuje epigenomické profilování s nižším vstupem". Přírodní buněčná biologie. 21. doi:10.1038 / s41556-018-0248-3. PMID  30532068.
  6. ^ Ohkawa Y, Kimura H, Handa T, Harada A, Maehara K (20. prosince 2018). "Podrobný protokol ─ Označení integrace chromatinu". Výměna protokolů. doi:10.1038 / protex.2018.122.
  7. ^ Handa, Tetsuya; Harada, Akihito; Maehara, Kazumitsu; Sato, Shoko; Nakao, Masaru; Goto, Naoki; Kurumizaka, Hitoshi; Ohkawa, Yasuyuki; Kimura, Hiroshi (říjen 2020). „Chromatinové integrační značení pro mapování proteinů vázajících DNA a modifikací s nízkým vstupem“. Přírodní protokoly. 15 (10): 3334–3360. doi:10.1038 / s41596-020-0375-8. PMID  32807906. Citováno 3. prosince 2020.