ŘEZÁNÍ a řazení značek - CUT&Tag sequencing

ŘEZÁNÍ a řazení značek, také známý jako štěpení pod cíli a značení, je metoda používaná k analýze protein interakce s DNA. Sekvence CUT & Tag kombinuje řízené štěpení zaměřené na protilátky a protein A -Tn5 fúze s masivně paralelní Sekvenování DNA identifikovat vazebná místa proteinů asociovaných s DNA. Může být použit k mapování globálních DNA vazebných míst přesně pro jakýkoli požadovaný protein. V současné době, ChIP-sekv je nejběžnější technikou používanou ke studiu vztahů bílkovina-DNA, ale trpí řadou praktických a ekonomických omezení, která CUT & RUN a sekvence CUT & Tag ne. Sekvence CUT & Tag je vylepšení CUT & RUN protože nevyžaduje lyžování buněk ani frakcionaci chromatinu.[1] CUT & RUN není vhodný pro jednobuněčné platformy, takže CUT & Tag je pro ně výhodné.[2]

Použití

Sekvenování CUT & Tag lze použít k vyšetření genové regulace nebo k analýze transkripční faktor a další vazba na protein spojená s chromatinem. Interakce protein-DNA regulují genová exprese a jsou odpovědné za mnoho biologických procesů a chorobných stavů. Tento epigenetický informace doplňují genotyp a analýza výrazu. CUT & Tag je alternativou k současnému standardu ChIP-sekv. ChIP-Seq trpí omezeními kvůli kroku zesíťování v protokolech ChIP-Seq, které mohou podporovat maskování epitopů a generovat falešně pozitivní vazebná místa.[3][4] ChIP-seq také trpí suboptimálními poměry signálu k šumu a špatným rozlišením.[5] Sekvence CUT & Run a CUT & Tag mají tu výhodu, že jsou jednoduššími technikami s nižšími náklady díky vysokému poměru signálu k šumu, což vyžaduje menší hloubku sekvenování.[6][2]

Specifická místa DNA v přímé fyzické interakci s proteiny, jako jsou transkripční faktory, lze izolovat pomocí Protein-A (pA) konjugovaný Tn5 vázán na sledovaný protein. Štěpení zprostředkované Tn5 produkuje knihovnu cílových míst DNA navázaných na požadovaný protein in situ. Sekvenování připravených knihoven DNA a srovnání s databázemi sekvencí celého genomu umožňuje vědcům analyzovat interakce mezi cílovými proteiny a DNA, stejně jako rozdíly v epigenetice chromatin modifikace. Proto může být metoda CUT & Tag použita na proteiny a modifikace, včetně transkripční faktory, polymerázy, strukturní proteiny, modifikace proteinů a modifikace DNA.

Sekvenování

Na rozdíl od ChIP-Seq není před sekvenováním vyžadován výběr velikosti. Jediný běh sekvenování může prohledat asociace celého genomu s vysokým rozlišením kvůli nízkému pozadí dosaženému provedením reakce in situ metodikou sekvenování CUT & RUN. ChIP-Seq naopak vyžaduje desetinásobek hloubky sekvenování kvůli skutečně vysokému pozadí spojenému s metodou.[7] Data jsou poté sbírána a analyzována pomocí softwaru, který srovnává sekvence vzorků se známou genomovou sekvencí za účelem identifikace fragmentů DNA CUT & Tag.[2]

Protokoly

V úložišti metod otevřeného přístupu jsou k dispozici podrobné pracovní postupy CUT & Tag.

Citlivost

CUT & Run-Sequencing nebo CUT & Tag-Sequencing poskytují nízkou úroveň signálu na pozadí z důvodu in situ profilování, které si zachovává in vivo 3D potvrzení interakcí transkripční faktor-DNA, takže protilátky mají přístup pouze k exponovaným povrchům. Citlivost sekvenování závisí na hloubce běhu sekvenování (tj. Počtu mapovaných značek sekvence), velikosti genomu a distribuci cílového faktoru. Hloubka sekvenování přímo koreluje s náklady a negativně koreluje s pozadím. Sekvenování CUT a značek na nízkém pozadí je proto ze své podstaty nákladově efektivnější než sekvenování ChIP na vysokém pozadí.

Špičkové volání zastoupení pro H3K27me3 cílené výsledky sekvenování, porovnání CUT & RUN s tradičním čipem. Všimněte si, že se zdá, že CUT & RUN a CUT & Tag poskytují vylepšený poměr signálu k šumu než tradiční čip. Tato výhoda se promítá do nižších nákladů na sekvenování (a proveditelnosti v jednotlivých buňkách pro CUT & Tag).

Omezení

Primárním omezením CUT & Tag-seq je pravděpodobnost nadměrného trávení DNA v důsledku nevhodného načasování reakce Tn5 závislé na hořčíku. Podobné omezení existuje pro současné protokoly ChIP-Seq, kde musí být optimalizováno enzymatické nebo sonikované stříhání DNA. Stejně jako u ChIP-sekv je vyžadována kvalitní protilátka cílená na požadovaný protein.

Podobné metody

  • Sono-Seq: Totožné s ChIP-Seq, ale bez kroku imunoprecipitace.
  • HITS-CLIP: Také zvaný CLIP-sekv, používané k detekci interakcí s RNA spíše než DNA.
  • PAR-CLIP: Metoda pro identifikaci vazebných míst buněk Proteiny vázající RNA.
  • RIP čip: Podobně jako ChIP-Seq, ale nepoužívá metody síťového propojení a využívá microarray analýza místo sekvenování.
  • SELEX: Zaměstnáno k určení konsensuálních vazebných sekvencí.
  • Soutěžní čip: Měří relativní dynamiku náhrady na DNA.
  • ChiRP-sekv: Měří DNA a proteiny vázané na RNA.
  • ChIP-exo: Využívá zpracování exonukleázou k dosažení rozlišení až jednoho páru bazí
  • ChIP-nexus: Potenciální zlepšení na ChIP-exo, schopný dosáhnout až rozlišení jednoho páru bází.
  • DRIP-seq: Používá protilátku S9.6 k vysrážení třířetězcových hybridů DND: RNA R-smyčky.
  • TCP-seq: Principiálně podobná metoda měření dynamiky translace mRNA.
  • POŠKOZENO: Používá obohacení methylovaných sekvencí DNA k detekci interakce protein-DNA bez protilátek.
  • CUT & RUN: Používá protein A-Mnase

Viz také

Reference

  1. ^ „CUT & Tag: vyšší rozlišení, levnější způsob mapování chromatinu“. Fred Hutchinson Cancer Research Center. 29. dubna 2019. Citováno 23. prosince 2019.
  2. ^ A b C Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo ES, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S (duben 2019). „CUT & Tag pro efektivní epigenomické profilování malých vzorků a jednotlivých buněk“. Příroda komunikace. 10 (1): 1930. Bibcode:2019NatCo..10.1930K. doi:10.1038 / s41467-019-09982-5. PMC  6488672. PMID  31036827.
  3. ^ Meyer CA, Liu XS (listopad 2014). „Identifikace a zmírnění zkreslení v metodách sekvenování příští generace pro biologii chromatinu“. Recenze přírody. Genetika. 15 (11): 709–21. doi:10.1038 / nrg3788. PMC  4473780. PMID  25223782.
  4. ^ Baranello L, Kouzine F, Sanford S, Levens D (květen 2016). "Předpětí ChIP jako funkce doby síťování". Chromozomový výzkum. 24 (2): 175–81. doi:10.1007 / s10577-015-9509-1. PMC  4860130. PMID  26685864.
  5. ^ He C, Bonasio R (únor 2017). „Řez výše“. eLife. 6. doi:10,7554 / eLife.25000. PMC  5310838. PMID  28199181.
  6. ^ Skene PJ, Henikoff S (leden 2017). „Efektivní cílená nukleázová strategie pro mapování vazebných míst DNA ve vysokém rozlišení“. eLife. 6. doi:10,7554 / eLife.21856. PMC  5310842. PMID  28079019.
  7. ^ „Stále používáte ChIP? Vyzkoušejte CUT & RUN pro vylepšené profilování chromatinu“. EpiCypher. Citováno 2019-07-26.
  8. ^ Kaya-Okur, Hatice; Henikoff, Steven. „Bench top CUT & Tag: pro efektivní epigenomické profilování malých vzorků a jednotlivých buněk v2 (protocols.io.zcpf2vn)“. doi:10.17504 / protocols.io.zcpf2vn. Archivovány od originál dne 19. 8. 2013. Citováno 2020-07-11.
  9. ^ Kaya-Okur, Hatice; Henikoff, Steven. „Bench top CUT & Tag: pro efektivní epigenomické profilování malých vzorků a jednotlivých buněk v1 (protocols.io.zcpf2vn)“. doi:10.17504 / protocols.io.wnufdew. Archivovány od originál dne 19. 8. 2013. Citováno 2020-07-11.