Virové neuronové trasování - Viral neuronal tracing

Neuron PC12 infikovaný virem pseudorabies PRV GS443 (označený zeleně). Zelené tečky pohybující se od těla buňky ukazují anterográdní doprava.

Virové neuronové trasování je použití a virus dohledat nervové dráhy, poskytující samoreplikaci sledovač. Viry mají výhodu vlastní replikace oproti molekulárním stopovacím látkám, ale mohou se také šířit příliš rychle a způsobit degradaci nervové tkáně. Viry, které mohou infikovat nervový systém, tzv neurotropní viry, se šíří prostorově blízkými soustavami neuronů synapse, což umožňuje jejich použití při studiu funkčně propojených neuronových sítí.[1][2] Použití virů k označení funkčně spojených neuronů vychází z práce odvedené Albert Sabin kdo vyvinul a biotest který by mohl posoudit infekci viry napříč neurony.[3] Následující výzkum umožnil začlenění imunohistochemické techniky systematického označování neuronových spojení.[3] Dosud se viry používaly ke studiu více obvodů v nervovém systému.

Dějiny

Většina neuroanatomists souhlasí s tím, že pochopení toho, jak je mozek propojen se sebou a tělem, má zásadní význam.[4] Proto je stejně důležité mít způsob, jak vizualizovat a studovat souvislosti mezi nimi neurony. Metody sledování neuronů nabízejí nebývalý pohled na morfologie a konektivita neuronových sítí. V závislosti na použitém indikátoru to může být omezeno na jeden neuron nebo může postupovat transsynapticky do sousedních neuronů. Poté, co se indikátor značně rozšířil, lze rozsah měřit buď pomocí fluorescence (pro barviva) nebo imunohistochemie (pro biologické stopovací látky). Důležitou inovací v této oblasti je použití neurotropní viry jako stopovací látky. Ty se nejen šíří po celém počátečním místě infekce, ale mohou i přeskočit synapse. Použití viru poskytuje samoreplikující se stopovací látku. To může umožnit objasnění nervové mikroobvody v rozsahu, který byl dříve nedosažitelný. To má významné důsledky pro skutečný svět. Pokud dokážeme lépe pochopit, které části mozku jsou úzce propojeny, můžeme předpovědět účinek lokalizovaného poranění mozku. Například pokud má pacient cévní mozkovou příhodu amygdala, primárně odpovědný za emoce, pacient by také mohl mít potíže naučit se vykonávat určité úkoly, protože amygdala je vysoce propojená s orbitofrontální kůra, zodpovědný za odměňování za učení. Prvním krokem k vyřešení problému je jako vždy jeho úplné pochopení, takže pokud máme mít jakoukoli naději na opravu poranění mozku, musíme nejprve pochopit jeho rozsah a složitost.[5]

Životní cyklus viru

The životní cyklus virů, jako jsou ty, které se používají při sledování neuronů, se liší od buněčných organismy. Viry jsou parazitický v přírodě a samy se nemohou množit. Proto musí infikovat jiný organismus a účinně unést buněčnou techniku, aby dokončili svůj životní cyklus. Je nazývána první fáze virového životního cyklu virový vstup. To definuje způsob, jakým virus infikuje novou hostitelskou buňku. V přírodě jsou neurotropní viry obvykle přenášeny kousnutím nebo škrábanci, jako v případě Virus vztekliny nebo určité kmeny Herpes viry. V trasovacích studiích k tomuto kroku dochází uměle, obvykle pomocí injekční stříkačky. Nazývá se další fáze virového životního cyklu virová replikace. Během této fáze virus přebírá strojní zařízení hostitelské buňky, aby způsobil, že buňka vytvoří více virových proteinů a shromáždí více virů. Jakmile buňka vyprodukuje dostatečný počet virů, virus vstoupí do virové vylučování etapa. Během této fáze viry opouštějí původní hostitelskou buňku při hledání nového hostitele. V případě neurotropních virů k tomuto přenosu obvykle dochází na synapse. Viry mohou skákat přes relativně krátký prostor z jednoho neuronu do druhého. Díky této vlastnosti jsou viry tak užitečné při stopovacích studiích. Jakmile virus vstoupí do další buňky, cyklus začíná znovu. Původní hostitelská buňka se začne degradovat po fázi vylučování. Ve stopovacích studiích je to důvod, proč musí být načasování přísně kontrolováno. Pokud se virus nechá rozšířit příliš daleko, původní mikroobvod, který nás zajímá, se degraduje a nelze získat žádné užitečné informace. Viry obvykle mohou infikovat pouze malý počet organismů a dokonce i jen specifický buněčný typ v těle. Specifičnost konkrétního viru pro konkrétní tkáň je známá jako jeho tropismus. Viry ve sledovacích studiích jsou všechny neurotropní (schopné infikovat neurony).[6]

Metody

Infekce

Virový indikátor může být zaveden do periferních orgánů, jako je a sval nebo žláza.[7] Některé viry, jako např virus spojený s adeno mohou být vstřikovány do krevního oběhu a procházet hematoencefalická bariéra infikovat mozek.[8] Může být také zaveden do a ganglion nebo injekčně přímo do mozku pomocí a stereotaktické zařízení. Tyto metody nabízejí jedinečný pohled na to, jak jsou propojeny mozek a jeho periferie. Viry se zavádějí do neuronální tkáně mnoha různými způsoby. Existují dvě hlavní metody pro zavedení stopovače do cílových tkání. Vstřikování tlaku vyžaduje, aby byl indikátor v kapalné formě injikován přímo do buňky. Toto je nejběžnější metoda. Ionoforéza zahrnuje aplikaci proudu do sledovacího roztoku uvnitř elektrody. Sledovací molekuly vyzvednou náboj a jsou poháněny do buňky prostřednictvím elektrického pole. Toto je užitečná metoda, pokud chcete po provedení označit buňku svorka technika.[5] Jakmile je stopovač zaveden do buňky, převezmou jej výše zmíněné transportní mechanismy. Jakmile je virus zaveden do nervového systému, začne infikovat buňky v místní oblasti. Viry fungují začleněním vlastního genetického materiálu do genomu infikovaných buněk.[9] Hostitelská buňka poté bude produkovat proteiny kódované genem. Vědci jsou schopni začlenit do infikovaných neuronů řadu genů, včetně fluorescenční proteiny používané pro vizualizaci.[9] Další pokroky v neuronovém trasování umožňují cílenou expresi fluorescenčních proteinů na specifické buněčné typy.[9]

Histologie a zobrazování

Jakmile se virus rozšířil v požadovaném rozsahu, mozek byl nakrájen na plátky a nasazen na snímky. Potom fluorescenční protilátky specifické pro virus nebo fluorescenční komplementární DNA sondy pro virovou DNA jsou promyty přes řezy a zobrazeny pod a fluorescenční mikroskop.[5]

Směr přenosu

Viry lze přenášet jedním ze dvou směrů. Nejprve je třeba pochopit základní mechanismus axoplazmatický transport. V rámci axon jsou dlouhé štíhlé proteinové komplexy zvané mikrotubuly. Chovají se jako cytoskelet pomoci buňce udržet si svůj tvar. Mohou také působit jako dálnice v axonu a usnadňovat přepravu neurotransmiter -plněné vezikuly a enzymy tam a zpět mezi tělem buňky, nebo soma a axonový terminál, nebo synapse. Transport může probíhat v obou směrech: anterográdní (od soma do synapse), nebo retrográdní (od synapse do soma). Neurony se přirozeně transportují bílkoviny, neurotransmitery a další makromolekuly těmito buněčnými cestami. Neuronové indikátory, včetně virů, využívají těchto transportních mechanismů k distribuci indikátoru v buňce. Vědci to mohou použít ke studiu synaptických obvodů.

Anterográdní doprava

Anterográdní trasování je použití indikátoru, který se pohybuje od soma k synapse. Anterográdní transport využívá protein zvaný kinesin pohybovat viry podél axonu v anterográdním směru.[5]

Retrográdní doprava

Retrográdní trasování je použití indikátoru, který se pohybuje od synapse po soma. Retrográdní transport využívá protein zvaný dynein pohybovat viry podél axonu v retrográdním směru.[5][10] Je důležité si uvědomit, že různé stopovací látky vykazují charakteristické afinity k dyneinu a kinesinu, a tak se budou šířit různými rychlostmi.

Duální přeprava

Někdy je žádoucí sledovat neurony před a za, aby se určily jak vstupy, tak výstupy nervových obvodů. Používá se kombinace výše uvedených mechanismů.[11]

Výhody a nevýhody

Použití virů jako stopovacích látek má své výhody a nevýhody. Jako takové existují některé aplikace, ve kterých jsou viry vynikajícím indikátorem, a další aplikace, ve kterých existují lepší metody.

Výhody

Jednou z výhod používání virových stopovacích látek je schopnost viru přeskakovat synapse. To umožňuje sledování mikroobvodů i projekční studie. Několik molekulárních indikátorů to dokáže a ty, které mohou mít obvykle snížený signál v sekundárních neuronech. Další výhodou virového sledování je proto schopnost virů samoreplikovat se. Jakmile je sekundární neuron infikován, virus se začne množit a replikovat. Nedochází ke ztrátě signálu, protože se stopař šíří mozkem.[6]

Nevýhody

Přestože některé vlastnosti virů mají při sledování řadu výhod, jiné představují potenciální problémy. Jak se šíří nervovým systémem, virové stopové látky infikují neurony a nakonec je ničí. Proto musí být načasování stopovacích studií přesné, aby bylo možné adekvátní šíření před tím, než dojde k neurální smrti. Viry mohou být nejen škodlivé pro nervovou tkáň, ale také škodlivé pro tělo jako celek. Proto bylo obtížné najít viry, které se k danému úkolu dokonale hodí. Virus používaný ke sledování by měl být v ideálním případě dostatečně infekční, aby poskytoval dobré výsledky, ale ne natolik, aby zničil nervovou tkáň příliš rychle nebo představoval zbytečná rizika pro exponované osoby. Další nevýhodou je, že sledování virových neuronů v současné době vyžaduje další krok připojení fluorescenčních protilátek k virům k vizualizaci cesty. Naproti tomu většina molekulárních indikátorů je pestrobarevná a lze je sledovat pouhým okem bez dalších úprav.

Aktuální použití

Virové trasování se primárně používá ke sledování neuronových obvodů. Vědci používají jeden z dříve zmíněných virů ke studiu toho, jak jsou neurony v mozku navzájem spojeny s velmi jemnou úrovní detailů.[12] Připojení do značné míry určuje, jak funguje mozek. Viry byly použity ke studiu gangliových obvodů sítnice,[13] kortikální obvody,[14] a mimo jiné páteřní obvody.

Používané viry

Následuje seznam aktuálně používaných virů pro účely neuronového sledování.

Reference

  1. ^ Ugolini, Gabriella (2010). "Pokroky ve virovém transneuronovém sledování". Journal of Neuroscience Methods. 194 (1): 2–20. doi:10.1016 / j.jneumeth.2009.12.001. PMID  20004688. S2CID  43490041.
  2. ^ Koyuncu, Orkide O .; Hogue, Ian B .; Enquist, Lynn W. (2013). „Virové infekce v nervovém systému“. Mobilní hostitel a mikrob. 13 (4): 379–393. doi:10.1016 / j.chom.2013.03.010. PMC  3647473. PMID  23601101.
  3. ^ A b Sams, J. M .; Jansen, A. S .; Mettenleiter, T. C .; Loewy, A. D. (1995-07-31). "Mutanti viru Pseudorabies jako transneuronální markery". Výzkum mozku. 687 (1–2): 182–190. doi:10.1016/0006-8993(95)00484-8. ISSN  0006-8993. PMID  7583303. S2CID  21516719.
  4. ^ Perkel, Jeffrey M. (18.01.2013). „TECHNOLOGIE ŽIVOTNÍ VĚDY: This is your Brain: Mapping the Connectome“. Věda. 339 (6117): 350–352. Bibcode:2013Sci ... 339..350P. doi:10.1126 / science.339.6117.350. ISSN  0036-8075.
  5. ^ A b C d E Oztas E (2003). "Neuronové trasování". Neuroanatomy. 2: 2–5.
  6. ^ A b Ginger, Melanie; Bony, Guillaume; Haberl, Matthias; Frick, Andreas (2014-10-28). Biologie a patogeneze rhabdo- a filovirů. SVĚT VĚDECKÝ. 263–287. doi:10.1142/9789814635349_0011. ISBN  9789814635332.
  7. ^ Ugolini G (1995). „Specifičnost viru vztekliny jako transneuronového sledovače motorických sítí: přenos z hypoglosálních motoneuronů na připojené buněčné skupiny centrálního nervového systému druhého řádu a vyššího řádu. [Podpora výzkumu, mimo USA“]. J Comp Neurol. 356 (3): 457–480. doi:10,1002 / k.903560312. PMID  7642806.
  8. ^ „Injekce vysílá„ genetický náklad “do neuronů po celém těle - budoucnost“. Budoucnost. 2017-06-29. Citováno 2018-04-01.
  9. ^ A b C Callaway, Edward M (2008). „Trasování transneuronálního okruhu s neurotropními viry“. Aktuální názor v neurobiologii. 18 (6): 617–623. doi:10.1016 / j.conb.2009.03.007. PMC  2698966. PMID  19349161.
  10. ^ Wickersham I. R .; Finke S .; Conzelmann K. K .; Callaway E. M. (2007). „Retrográdní sledování neuronů pomocí viru vztekliny s mutací delece. [Research Support, N.I.H., Extramural Research Support, Non-U.S. Gov't]“. Nat metody. 4 (1): 47–49. doi:10.1038 / nmeth999. PMC  2755236. PMID  17179932.
  11. ^ Lopez I. P .; Salin P .; Kachidian P .; Barroso-Chinea P .; Rico A. J .; Gomez-Bautista V .; Lanciego J. L. (2010). „Přidaná hodnota viru vztekliny jako retrográdního indikátoru v kombinaci s duálním anterográdním trasováním. [Research Support, Non-U.S. Gov't]“. J Neurosciho metody. 194 (1): 21–27. doi:10.1016 / j.jneumeth.2010.01.015. PMID  20096304. S2CID  214343.
  12. ^ A b Ginger M .; Haberl M .; Conzelmann K.-K .; Schwarz M .; Frick A. (2013). „Odhalení tajemství neuronových obvodů pomocí technologie rekombinantního viru vztekliny. [Podpora výzkumu, mimo USA, recenze vlád]“. Přední. Neuronové obvody. 7: 2. doi:10.3389 / fncir.2013.00002. PMC  3553424. PMID  23355811.
  13. ^ Viney T. J .; Balint K .; Hillier D .; Siegert S .; Boldogkoi Z .; Enquist L. W .; Roska B. (2007). „Místní sítnicové obvody gangliových buněk obsahujících melanopsin identifikované transsynaptickým sledováním virů. [Research Support, Non-U.S. Gov't Research Support, U.S. Gov't, Non-P.H.S.]“. Curr Biol. 17 (11): 981–988. doi:10.1016 / j.cub.2007.04.058. PMID  17524644. S2CID  2388142.
  14. ^ Ugolini G (2011). „Virus vztekliny jako transneuronální indikátor neuronových spojení. [Research Support, Non-US. Gov't Review]“. Adv Virus Res. 79: 165–202. doi:10.1016 / B978-0-12-387040-7.00010-X. PMID  21601048.
  15. ^ McGovern AE, Davis-Poynter N, Rakoczy J, Phipps S, Simmons DG, Mazzone SB .; Davis-Poynter; Rakoczy; Phipps; Simmons; Mazzone (30. července 2012). "Anterográdní sledování neuronových obvodů pomocí geneticky modifikovaného viru herpes simplex exprimujícího EGFP". J Neurosciho metody. 209 (1): 158–67. doi:10.1016 / j.jneumeth.2012.05.035. PMID  22687938. S2CID  20370171.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  16. ^ Norgren, R. B., Jr., & Lehman, M. N .; Lehman (1998). "Virus Herpes simplex jako transneuronální stopovací látka. [Recenze]". Neurosci Biobehav Rev. 22 (6): 695–708. doi:10.1016 / s0149-7634 (98) 00008-6. PMID  9809305. S2CID  40884240.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  17. ^ Koyuncu OO, Perlman DH, Enquist LW; Perlman; Enquist (16. ledna 2013). „Efektivní retrográdní transport viru pseudorabies v neuronech vyžaduje lokální syntézu proteinů v axonech“. Buněčný hostitelský mikrob. 13 (1): 54–66. doi:10.1016 / j.chom.2012.10.021. PMC  3552305. PMID  23332155.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  18. ^ Kratchmarov R, Taylor MP, Enquist LW; Taylor; Enquist (2013). "Role nás9 fosforylace v axonálním třídění a anterográdním přenosu viru pseudorabies". PLOS ONE. 8 (3): e58776. Bibcode:2013PLoSO ... 858776K. doi:10.1371 / journal.pone.0058776. PMC  3602541. PMID  23527020.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  19. ^ Kelly, R. M. a Strick, P. L .; Strick (2000). „Vzteklina jako transneuronální stopovač obvodů v centrální nervové soustavě. [Research Support, US Gov't, Non-P.H.S. Research Support, US Gov't, P.H.S. Review]“. J Neurosciho metody. 103 (1): 63–71. doi:10.1016 / S0165-0270 (00) 00296-X. PMID  11074096. S2CID  17492937.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  20. ^ Ugolini, G. (2008). „Použití viru vztekliny jako transneuronového stopovače neuronových spojení: důsledky pro pochopení patogeneze vztekliny. [Research Support, Non-US. Gov't Review]“. Dev Biol (Basilej). 131: 493–506. PMID  18634512.
  21. ^ Beier K. T .; Saunders A .; Oldenburg I. A .; Miyamichi K .; Akhtar N .; Luo L .; Whelang SPJ; Sabatini B; Cepko C. L. (2011). "Anterográdní nebo retrográdní transsynaptické značení neuronů CNS vektory viru vezikulární stomatitidy". Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37): 15414–15419. doi:10.1073 / pnas.1110854108. PMC  3174680. PMID  21825165.
  22. ^ Beier KT, Saunders AB, Oldenburg IA, Sabatini BL, Cepko CL; Saunders; Oldenburg; Sabatini; Cepko (2013). „Virus vezikulární stomatitidy s glykoproteinem viru vztekliny řídí retrográdní transsynaptický transport mezi neurony in vivo“. Hranice v neurálních obvodech. 7 (11): 1–13. doi:10.3389 / fncir.2013.00011. PMC  3566411. PMID  23403489.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  23. ^ Beier KT, Saunders AB, Oldenburg IA, Sabatini BL, Cepko CL; Tomioka; Taki; Nakamura; Tamamaki; Kaneko (2001). „In vivo transdukce centrálních neuronů pomocí rekombinantního viru Sindbis: Golgiho označení dendritů a axonů pomocí fluorescenčních proteinů zaměřených na membránu“. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (12): 1497–1507. doi:10.1177/002215540104901203. PMID  11724897.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  24. ^ Chamberlin NL, Du B, de Lacalle S, Saper CB; Du; De Lacalle; Saper (18. května 1998). "Rekombinantní adeno-asociovaný virový vektor: použití pro expresi transgenu a sledování anterográdního traktu v CNS". Brain Res. 793 (1–2): 169–75. doi:10.1016 / s0006-8993 (98) 00169-3. PMC  4961038. PMID  9630611.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)