Retrográdní trasování - Retrograde tracing

PVH neurony krysy Long-Evans označené retrográdním stopovacím fluoro-zlatem

Retrográdní trasování je výzkumná metoda používaná v neurovědy sledovat neurální spojení z jejich koncového bodu ( synapse ) k jejich zdroji ( buněčné tělo ). Techniky retrográdního sledování umožňují podrobné hodnocení neuronových spojení mezi cílovou populací neuronů a jejich vstupy v celém systému nervový systém. Tyto techniky umožňují „mapování“ spojení mezi neurony v konkrétní struktuře (např oko ) a cílové neurony v mozek. Opačná technika je anterográdní trasování, který se používá ke sledování neurálních spojení od jejich zdroje k jejich koncovému bodu (tj. od těla buňky k synapse). Anterográdní i retrográdní trasovací techniky jsou založeny na vizualizaci axonální transport.

Techniky

Retrográdní trasování lze dosáhnout různými způsoby, včetně použití virových kmenů jako markerů konektivity buňky k místu injekce. Například virus pseudorabies (PRV; kmen Bartha) může být použit jako vhodný indikátor kvůli náchylnosti infekce šířit se proti proudu cestou synapticky spojených neuronů, což odhaluje povahu jejich obvodů.[1][2]

Ukázalo se, že vzteklina je pro tento systém trasování obvodu účinná kvůli jeho nízké úrovni poškození infikovaných buněk, specifičnosti infikování pouze neuronů a přísnému omezení šíření virů mezi neurony do synaptických oblastí.[3] Tyto faktory umožňují vysoce specifické stopy, které mohou odhalit jednotlivá neuronální spojení v obvodu, aniž by způsobily fyzické poškození buněk.

Další technika spočívá ve vstřikování speciálních "kuliček" do mozek jádra anestetizovaných zvířat.[4] Zvířatům bylo umožněno přežít několik dní a poté byla utracena. Buňky v počátku projekce jsou vizualizovány obráceně fluorescenční mikroskop.

Wickersham a kolegové vyvinuli speciální techniku, která použila upravenou techniku vzteklina virus. Tento virus byl schopen infikovat jednu buňku a skákat přes jednu synapse; to vědcům umožnilo zkoumat místní konektivitu neuronů.[5]

Virus vztekliny

Poté, co byl přijat do synaptický terminál nebo axon cílového neuronu, virus vztekliny je zabalen do a váček který je transportován směrem k tělu buňky prostřednictvím axonu dynein. V divoký typ virus vztekliny, virus se bude i nadále replikovat a šířit po celém centrálním nervovém systému, dokud systémově neinfikuje celý mozek.[3] Delece genu kódujícího glykoprotein (G protein) u vztekliny omezuje šíření viru přísně na buňky, které byly původně infikovány. Transsynaptické šíření viru může být omezeno na monosynaptický přenos na neuron původu pseudotypizací G proteinu a podřízením genu Cre -řízení. Toto virové šíření lze vizualizovat pomocí metod zahrnujících přidání fluorescenčního genu, jako je zelený fluorescenční protein na virovou kazeta nebo skrz imunohistochemie.[6][7]

Virus Pseudorabies

Člen herpesviridae rodina, pseudorabies virus se šíří přes CNS jak retrográdním, tak anterográdním způsobem a pohybuje se neurálním axonem do soma a dendritů v retrográdní aplikaci. Delece tří klíčových genů membránových proteinů v kmeni PRV-Bartha z pseudorabies blokuje anterográdní šíření viru a umožňuje další manipulace s virovou DNA, jako je přidání fluorescence, což umožňuje retrográdní trasování obvodu.[8]

Fluoro-zlato

Fluoro-Gold, také známý jako hydroxystilbamidin, je ne-virový fluorescenční retrográdní indikátor, jehož pohyb po axonu a přes dendritický strom lze vizualizovat pomocí fluorescenční mikroskopie nebo imunohistochemie.[9]

Viz také

Reference

  1. ^ O'Donnell, P .; Lavín, A .; Enquist, L. W .; Grace, A. A .; Card, J. P. (1997). "Propojené paralelní obvody mezi krysím Nucleus Accumbens a thalamem odhaleny retrográdním transynaptickým transportem viru Pseudorabies". Journal of Neuroscience. 17 (6): 2143–2167. doi:10.1523 / jneurosci.17-06-02143.1997.
  2. ^ Luo, A. H .; Aston-Jones, G. (2009). „Projekce obvodu od suprachiasmatického jádra do ventrální tegmentální oblasti: nová cirkadiánní výstupní cesta“. European Journal of Neuroscience. 29 (4): 748–760. doi:10.1111 / j.1460-9568.2008.06606.x. PMC  3649071. PMID  19200068.
  3. ^ A b Davis, Benjamin M .; Rall, Glenn F .; Schnell, Matthias J. (06.11.2015). „Vše, co jste vždy chtěli vědět o viru vztekliny (ale báli jste se zeptat)“. Roční přehled virologie. 2 (1): 451–71. doi:10.1146 / annurev-virology-100114-055157. PMC  6842493. PMID  26958924.
  4. ^ Katz, L. C .; Burkhalter, A .; Dreyer, W. J. (08.08.1984). „Fluorescenční latexové mikrosféry jako retrográdní neuronální marker pro in vivo a in vitro studie zrakové kůry“. Příroda. 310 (5977): 498–500. Bibcode:1984 Natur.310..498K. doi:10.1038 / 310498a0. PMID  6205278.
  5. ^ Wickersham IR, Lyon DC, Barnard RJ a kol. (Březen 2007). „Monosynaptické omezení transsynaptického trasování od jednotlivých, geneticky zaměřených neuronů“. Neuron. 53 (5): 639–47. doi:10.1016 / j.neuron.2007.01.033. PMC  2629495. PMID  17329205.
  6. ^ TotalBoox; TBX (01.01.2011). Pokrok ve výzkumu vztekliny. Elsevierova věda. ISBN  9780123870414. OCLC  968996286.
  7. ^ Huang, Z. Josh; Zeng, Hongkui (10.7.2013). "Genetické přístupy k neurálním obvodům u myši". Roční přehled neurovědy. 36: 183–215. doi:10.1146 / annurev-neuro-062012-170307. PMID  23682658.
  8. ^ Enquist, L. W. (01.12.2002). „Využívání specifického šíření viru Pseudorabies v centrálním nervovém systému: poznatky o patogenezi a stopových obvody“. The Journal of Infectious Diseases. 186 (Dodatek_2): S209 – S214. doi:10.1086/344278. ISSN  0022-1899. PMID  12424699.
  9. ^ Naumann, T .; Härtig, W .; Frotscher, M. (2000-11-15). „Retrográdní trasování s Fluoro-Gold: různé metody detekce stopovacích látek na ultrastrukturální úrovni a neurodegenerativní změny zpětně vyplněných neuronů v dlouhodobých studiích“. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1): 11–21. doi:10.1016 / s0165-0270 (00) 00292-2. ISSN  0165-0270. PMID  11074092.

Další čtení

Retrográdní trasování bylo široce používáno v široké škále neurovědeckých studií, včetně následujících příkladů: