Transmisní elektronová kryomikroskopie - Transmission electron cryomicroscopy

Obrázek CryoTEM GroEL pozastaveno v amorfní led na 50000× zvětšení
Struktura Alkohol oxidáza z Pichia pastoris od CryoTEM

Transmisní elektronová kryomikroskopie (CryoTEM), běžně známý jako cryo-EM, je forma kryogenní elektronová mikroskopie, konkrétněji typ transmisní elektronová mikroskopie (TEM), kde je vzorek studován na kryogenní teploty (obecně tekutý dusík teploty).[1] Cryo-EM získává na popularitě strukturní biologie.[2]

Užitečnost kryomikroskopie transmisní elektrony vyplývá ze skutečnosti, že umožňuje pozorování vzorků, které nebyly nijak obarveny nebo fixovány, a ukazuje je v jejich přirozeném prostředí. To je v rozporu s Rentgenová krystalografie, což vyžaduje krystalizaci vzorku, což může být obtížné, a jejich umístění do nefyziologických prostředí, což může příležitostně vést k funkčně irelevantním konformačním změnám.

Pokroky v technologie detektoru elektronů, zejména DDE (Direct Electron Detectors) a také výkonnější softwarové zobrazovací algoritmy umožnily stanovení makromolekulárních struktur při rozlišení blízkém atomu. [3]Zobrazené makromolekuly zahrnují viry, ribozomy, mitochondrie, iontové kanály, a enzym komplexy. Počínaje rokem 2018 by kryo-EM mohl být aplikován na malé struktury hemoglobin (64 kDa )[4] as rozlišením až 1,8 A.[5] V roce 2019 představovaly kryo-EM struktury 2,5% struktur uložených v EU Proteinová datová banka,[6]a toto číslo stále roste.[7] Aplikace cryo-EM je kryo-elektronová tomografie (cryo-ET), kde je 3D rekonstrukce vzorku vytvořena z nakloněných 2D obrazů.

Rozvoj

Původní odůvodnění pro CryoTEM bylo prostředkem boje radiační poškození pro biologické vzorky. Množství záření potřebné ke shromáždění obrazu vzorku v elektronový mikroskop je dostatečně vysoká, aby byla potenciálním zdrojem poškození vzorků pro jemné struktury. Kromě toho vysoké vakuum požadované na sloupci elektronového mikroskopu činí prostředí pro vzorek dost drsným.

Problém vakua byl částečně vyřešen zavedením negativní skvrny ale i při negativních skvrnách jsou biologické vzorky náchylné ke strukturálnímu kolapsu dehydratace vzorku. Vložení vzorků do ledu pod sublimační teplotu bylo možností, o které se uvažovalo brzy, ale voda má tendenci se po zmrazení usazovat do krystalické mřížky s nižší hustotou, což může zničit strukturu všeho, co je do ní vloženo.

Na začátku 80. let se několik skupin studujících fyziku pevných látek pokoušelo produkovat skelný led různými způsoby, například vysokotlakým zmrazením nebo rychlým zmrazením. V seminární práci z roku 1984 skupina vedla o Jacques Dubochet na Evropská laboratoř molekulární biologie ukázal obrázky adenovirus zalité ve skleněné vrstvě vody.[8] Tento dokument je obecně považován za označení původu Cryo-EM a tato technika byla vyvinuta do té míry, že se stala rutinou v mnoha laboratořích po celém světě.

Energie elektronů použitých pro zobrazování (80–300 kV) je dostatečně vysoká na to kovalentní vazby lze zlomit. Pokud jsou zobrazovací vzorky citlivé na radiační poškození, je nutné omezit expozici elektronů použitou k získání obrazu. Tyto nízké expozice vyžadují, aby byly obrazy tisíců nebo dokonce milionů identických zmrazených molekul vybrány, srovnány a zprůměrovány, aby se získaly mapy s vysokým rozlišením pomocí specializovaného softwaru. Výrazného zlepšení strukturálních vlastností bylo v roce 2012 dosaženo zavedením přímé detektory elektronů a lepší výpočetní algoritmy.[1][2]

V roce 2015 Bridget Carragherová a kolegové v Scripps National Resource for Automated Molecular Microscopy použili techniky ona a Clint Potter vyvinuto k určení první kryo-EM struktury s rozlišením jemnějším než 3 Å, čímž povýší CryoTEM jako nástroj srovnatelný a potenciálně lepší než tradiční rentgenové krystalografické techniky.[9][10] Od té doby bylo dosaženo vyšších rozlišení, včetně 2,2 Á struktury bakteriálního enzymu β-galaktosidáza v roce 2015[11] a 1,8 Å struktura glutamát dehydrogenáza v roce 2016.[12] Cryo-EM se také používá ke stanovení struktury různých virů, včetně virů Virus Zika,[13] a byl aplikován na velké komplexy, jako je spliceosome.[14] V roce 2017 Nobelova cena za chemii byla společně udělena Jacques Dubochet, Joachim Frank a Richard Henderson, „pro vývoj kryoelektronové mikroskopie pro stanovení struktury biomolekul v roztoku ve vysokém rozlišení“.[15]

Biologické vzorky

Tenký film

Biologický materiál se šíří na mřížce elektronového mikroskopu a je konzervován v a zmrazený hydratovaný stav rychlým zmrazením, obvykle v kapalině etan u tekutý dusík teplota. Udržováním vzorků při teplotě kapalného dusíku nebo nižší teplotě je lze zavádět do vysocevakuum z elektronový mikroskop sloupec. Většina biologických vzorků je extrémně vysoká radiosenzitivní, takže musí být zobrazovány technikami s nízkými dávkami (užitečné je, že nízká teplota kryomikroskopie transmisní elektrony poskytuje další ochranný faktor proti poškození radiací).

V důsledku toho jsou obrázky extrémně vysoké hlučný. U některých biologických systémů je možné průměrovat obrazy za účelem zvýšení poměru signál-šum a získat informace o vzorku ve vysokém rozlišení pomocí techniky známé jako analýza jednotlivých částic. Tento přístup obecně vyžaduje, aby průměrované věci byly totožné, i když nyní lze studovat určitou omezenou konformační heterogenitu (např. ribozom ). Trojrozměrné rekonstrukce ze snímků CryoTEM proteinových komplexů a viry byly vyřešeny na subnanometr nebo téměř atomové rozlišení, což umožnilo nové pohledy na strukturu a biologii těchto velkých sestav.

Analýza uspořádaných polí proteinu, jako je 2-D krystaly z transmembránové proteiny nebo spirálovitý pole proteinů, také umožňuje určitý druh průměrování, který může poskytnout informace o vzorku ve vysokém rozlišení. Tato technika se nazývá elektronová krystalografie.

Skelné části

Metoda tenkého filmu je omezena na tenké vzorky (typicky <500 nm), protože elektrony nemohou procházet silnějšími vzorky bez vícenásobného rozptylu. Tlustší vzorky lze vitrifikovat ponorným zmrazením (kryofixace ) v etanu (do tloušťky desítek μm) nebo častěji do vysokotlaké zmrazení (až stovky μm). Poté je lze řezat na tenké úseky (tl. 40 až 200 nm) diamantovým nožem v a cryoultramicrotome při teplotách nižších než -135 ° C (teplota devitrifikace). Řezy jsou shromážděny na mřížce elektronového mikroskopu a jsou zobrazeny stejným způsobem jako vzorek vitrifikovaný v tenkém filmu. Tato technika se nazývá transmisní elektronová kryomikroskopie sklivcových sekcí (CEMOVIS) nebo transmisní elektronová kryomikroskopie zmrazených hydratovaných sekcí.

Materiálové vzorky

Kromě toho, že umožňuje zobrazení vitrifikovaných biologických vzorků, lze CryoTEM také použít k zobrazení vzorků materiálu, které jsou ve vakuu příliš těkavé, aby se zobrazily pomocí standardní elektronové mikroskopie při pokojové teplotě. Například vitrifikované části rozhraní kapalina-pevná látka lze extrahovat pro analýzu pomocí CryoTEM,[16] a síru, která je náchylná k sublimaci ve vakuu elektronových mikroskopů, lze stabilizovat a zobrazit v CryoTEM.[17]

Techniky

V CryoTEMu lze použít různé techniky.[18] Mezi oblíbené techniky patří:

  1. Elektronová krystalografie
    1. Analýza dvourozměrných krystalů
    2. Analýza spirálovitých vláken nebo trubek
    3. Mikrokrystalická elektronová difrakce (MicroED)[19][20][21][22]
  2. Analýza jednotlivých částic (LÁZNĚ)
    1. Časem vyřešený CryoTEM[23][24][25]
  3. Elektronová kryotomografie (cryoET)

Viz také

Reference

  1. ^ A b Kühlbrandt W (srpen 2014). „Kryo-EM vstupuje do nové éry“. eLife. 3: e03678. doi:10,7554 / elife.03678. PMC  4131193. PMID  25122623.
  2. ^ A b Callaway E (září 2015). „Revoluce nebude krystalizována: strukturální biologií projde nová metoda“. Příroda. 525 (7568): 172–4. Bibcode:2015 Natur.525..172C. doi:10.1038 / 525172a. PMID  26354465.
  3. ^ Murata K, Wolf M (únor 2018). "Kryoelektronová mikroskopie pro strukturní analýzu dynamických biologických makromolekul". Biochimica et Biophysica Acta. doi:10.1016 / j.bbagen.2017.07.020.
  4. ^ Khoshouei M, Radjainia M, Baumeister W, Danev R (červen 2017). „Kryo-EM struktura hemoglobinu při 3,2 Á stanovena pomocí fázové desky Volta“. Příroda komunikace. 8: 16099. doi:10.1038 / ncomms16099. PMC  5497076. PMID  28665412.
  5. ^ Merk A, Bartesaghi A, Banerjee S, Falconieri V, Rao P, Davis MI, Pragani R, Boxer MB, Earl LA, Milne JL, Subramaniam S (červen 2016). „Překonávání překážek rozlišení Cryo-EM pro usnadnění objevování drog“. Buňka. 165 (7): 1698–1707. doi:10.1016 / j.cell.2016.05.040. PMC  4931924. PMID  27238019.
  6. ^ „Distribuce dat PDB experimentální metodou a molekulárním typem“. www.rcsb.org. Citováno 2019-12-03.
  7. ^ „Statistika PDB: Růst struktur z 3DEM experimentů vydávaných za rok“. www.rcsb.org. Citováno 2018-12-22.
  8. ^ Adrian M, Dubochet J, Lepault J, McDowall AW (1984). "Kryoelektronová mikroskopie virů". Příroda. 308 (5954): 32–6. Bibcode:1984Natur.308 ... 32A. doi:10.1038 / 308032a0. PMID  6322001. S2CID  4319199.
  9. ^ Dellisanti, Cosma (2015). „Rozlišení překonávající bariéru“. Přírodní strukturní a molekulární biologie. 22 (5): 361. doi:10.1038 / nsmb.3025. S2CID  12198387.
  10. ^ Campbell MG, Veesler D, Cheng A, Potter CS, Carragher B (březen 2015). „Rekonstrukce rozlišení 2,8 Å proteazomu Thermoplasma acidophilum 20S pomocí kryoelektronové mikroskopie“. eLife. 4. doi:10,7554 / eLife.06380. PMC  4391500. PMID  25760083.
  11. ^ Bartesaghi A, Merk A, Banerjee S, Matthies D, Wu X, Milne JL, Subramaniam S (červen 2015). „2.2 Å rozlišení kryo-EM struktura β-galaktosidázy v komplexu s inhibitorem propouštějícím buňky“. Věda. 348 (6239): 1147–51. Bibcode:2015Sci ... 348.1147B. doi:10.1126 / science.aab1576. PMC  6512338. PMID  25953817.
  12. ^ Vonck J, Mills DJ (říjen 2017). „Pokroky v kryo-EM s vysokým rozlišením oligomerních enzymů“. Aktuální názor na strukturní biologii. 46: 48–54. doi:10.1016 / j.sbi.2017.05.016. PMID  28624735.
  13. ^ Sirohi D, Chen Z, Sun L, Klose T, Pierson TC, Rossmann MG, Kuhn RJ (duben 2016). „Kryo-EM struktura viru Zika s rozlišením 3,8 Å“. Věda. 352 (6284): 467–70. Bibcode:2016Sci ... 352..467S. doi:10.1126 / science.aaf5316. PMC  4845755. PMID  27033547.
  14. ^ Cheng Y (srpen 2018). „Jednočásticový kryo-EM-Jak se sem dostal a kam půjde“. Věda. 361 (6405): 876–880. doi:10.1126 / science.aat4346. PMC  6460916. PMID  30166484.
  15. ^ „Nobelova cena za chemii za rok 2017 - tisková zpráva“. www.nobelprize.org. 4. října 2017. Citováno 4. října 2017.
  16. ^ Zachman MJ, Asenath-Smith E, Estroff LA, Kourkoutis LF (prosinec 2016). „Specifická příprava neporušených rozhraní pevná látka-kapalina pomocí lokalizace v místě bez použití štítků a zvedání iontových paprsků zaměřených na kryo“. Mikroskopie a mikroanalýza. 22 (6): 1338–1349. Bibcode:2016MiMic..22.1338Z. doi:10.1017 / S1431927616011892. PMID  27869059.
  17. ^ Levin BD, Zachman MJ, Werner JG, Sahore R, Nguyen KX, Han Y, Xie B, Ma L, Archer LA, Giannelis EP, Wiesner U, Kourkoutis LF, Muller DA (únor 2017). „Charakterizace katarů síry a nanostrukturovaných sirných baterií v elektronové mikroskopii bez sublimačních artefaktů“. Mikroskopie a mikroanalýza. 23 (1): 155–162. Bibcode:2017MiMic..23..155L. doi:10.1017 / S1431927617000058. PMID  28228169.
  18. ^ Prezentace na kryoelektronové mikroskopii PharmaXChange.info
  19. ^ Shi D, Nannenga BL, Iadanza MG, Gonen T (listopad 2013). „Trojrozměrná elektronová krystalografie proteinových mikrokrystalů“. eLife. 2: e01345. doi:10,7554 / eLife.01345. PMC  3831942. PMID  24252878.
  20. ^ Nannenga BL, Shi D, Leslie AG, Gonen T (září 2014). „Stanovení struktury s vysokým rozlišením pomocí sběru dat s kontinuální rotací v MicroED“. Přírodní metody. 11 (9): 927–930. doi:10.1038 / nmeth.3043. PMC  4149488. PMID  25086503.
  21. ^ Shi D, Nannenga BL, de la Cruz MJ, Liu J, Sawtelle S, Calero G, Reyes FE, Hattne J, Gonen T (květen 2016). „Sběr dat MicroED pro makromolekulární krystalografii“. Přírodní protokoly. 11 (5): 895–904. doi:10.1038 / nprot.2016.046. PMC  5357465. PMID  27077331.
  22. ^ de la Cruz MJ, Hattne J, Shi D, Seidler P, Rodriguez J, Reyes FE, Sawaya MR, Cascio D, Weiss SC, Kim SK, Hinck CS, Hinck AP, Calero G, Eisenberg D, Gonen T (únor 2017) . „Struktury atomového rozlišení z fragmentovaných proteinových krystalů metodou cryoEM MicroED“. Přírodní metody. 14 (4): 399–402. doi:10.1038 / nmeth.4178. PMC  5376236. PMID  28192420.
  23. ^ Fu Z, Kaledhonkar S, Borg A, Sun M, Chen B, Grassucci RA, Ehrenberg M, Frank J (prosinec 2016). „Klíčové meziprodukty v recyklaci ribozomu vizualizované časově rozlišenou kryoelektronovou mikroskopií“. Struktura. 24 (12): 2092–2101. doi:10.1016 / j.str.2016.09.014. PMC  5143168. PMID  27818103.
  24. ^ Feng X, Fu Z, Kaledhonkar S, Jia Y, Shah B, Jin A, Liu Z, Sun M, Chen B, Grassucci RA, Ren Y, Jiang H, Frank J, Lin Q (duben 2017). „Rychlá a účinná metoda mikrofluidního stříkání a zanořování pro jednočásticový kryo-EM s vysokým rozlišením“. Struktura. 25 (4): 663–670.e3. doi:10.1016 / j.str.2017.02.005. PMC  5382802. PMID  28286002.
  25. ^ Chen B, Kaledhonkar S, Sun M, Shen B, Lu Z, Barnard D, Lu TM, Gonzalez RL, Frank J (červen 2015). "Strukturální dynamika asociace podjednotek ribozomu studována mícháním-postřikem časově rozlišenou kryogenní elektronovou mikroskopií". Struktura. 23 (6): 1097–105. doi:10.1016 / j.str.2015.04.007. PMC  4456197. PMID  26004440.

Další čtení

externí odkazy

Prostředky knihovny o
Kryomikroskopie