Mikrokrystalická elektronová difrakce - Microcrystal electron diffraction

Mikrokrystalická elektronová difrakcenebo MicroED,[1][2] je CryoEM metoda, která byla vyvinuta Gonen laboratoř koncem roku 2013 na Janelia Research Campus z Howard Hughes Medical Institute. MicroED je forma elektronová krystalografie kde tenké 3D krystaly jsou použity pro stanovení struktury pomocí elektronová difrakce.

Metoda byla vyvinuta pro strukturní stanovení proteinů z nanokrystaly které obvykle nejsou vhodné pro rentgenovou difrakci kvůli své velikosti. Krystaly o velikosti jedné miliardtiny potřebné pro rentgenovou krystalografii mohou poskytnout vysoce kvalitní data.[3] Vzorky jsou zmrazeny hydratované jako u všech ostatních modalit CryoEM, ale místo použití transmisní elektronový mikroskop (TEM ) v zobrazovacím režimu jej používáte v difrakce režim s extrémně nízkou expozicí elektronů (obvykle <0,01 e−/A2/ s). Nanokrystal je vystaven difrakčnímu paprsku a neustále se otáčí[2] zatímco difrakce se sbírá na rychlé kameře jako film.[2] Data MicroED se poté zpracovávají pomocí tradičního softwaru pro Rentgenová krystalografie bez potřeby specializovaného softwaru pro strukturní analýzu a zdokonalování.[4] Důležité je, že hardware i software použité v experimentu MicroED jsou standardní a široce dostupné.

Rozvoj

První úspěšná demonstrace MicroED byla hlášena v roce 2013 Gonen laboratoř.[1] Struktura lysozym, klasický testovací protein v Rentgenová krystalografie. Na začátku roku 2013 skupina Abrahams nezávisle hlásila 3D elektronová difrakce data pomocí a Medipix zapnut detektor kvantové oblasti lysozym krystaly, ale nebyli schopni vyřešit strukturu kvůli technickým omezením.[5]

Experimentální nastavení

Byly zveřejněny podrobné protokoly pro nastavení elektronového mikroskopu a pro sběr dat.[6]

Instrumentace

Mikroskop

Data MicroED se shromažďují pomocí transmisní elektronová (kryogenní) mikroskopie. Mikroskop musí být vybaven vybranou clonou pro použití difrakce vybrané oblasti.

Detektory

Ke shromažďování údajů o difrakci elektronů v experimentech MicroED byla použita celá řada detektorů. Využití detektorů nabíjecí zařízení (CCD) a komplementární kov-oxid-polovodič (CMOS) technologie. U detektorů CMOS lze interpretovat jednotlivé počty elektronů.[7]

Sběr dat

Stále difrakce

Počáteční důkaz zveřejnění konceptu na MicroED použil krystaly lysozymu.[1] Z jediného nano krystalu bylo sbíráno až 90 stupňů dat s diskrétními 1stupňovými kroky mezi snímky. Každý difrakční obrazec byl shromážděn s ultra nízkou dávkovou rychlostí ~ 0,01 e−/A2/ s. Data ze 3 krystalů byla sloučena, čímž byla získána rozlišovací struktura 2,9 Á s dobrou statistikou zdokonalení a představovala poprvé, kdy byla úspěšně použita elektronová difrakce ke stanovení struktury proteinu citlivého na dávku z 3D mikrokrystalů v kryogenních podmínkách.

Kontinuální otáčení stupně

Krátce poté, co byl prokázán principový papír, byl MicroED vylepšen použitím kontinuální rotace během schématu sběru dat.[2] Zde se krystal pomalu otáčí v jednom směru, zatímco difrakce se zaznamenává rychlou kamerou jako film. Metodika je jako metoda rotace v rentgenové krystalografii. To vedlo k několika vylepšením kvality dat a umožnilo zpracování dat pomocí standardního rentgenového krystalografického softwaru.[2] Mezi výhody plynulé rotace MicroED patří snížení dynamického rozptylu a lepší vzorkování vzájemného prostoru. Kontinuální rotace je standardní metodou sběru dat MicroED od roku 2014.

Zpracování dat

Byly zveřejněny podrobné protokoly pro zpracování dat MicroED.[4] Když jsou data MicroED shromažďována pomocí kontinuální rotace fází, standardně krystalografický software může být použito.

Rozdíly mezi MicroED a jinými elektronovými difrakčními metodami

Mezi další metody elektronové difrakce, které byly vyvinuty pro materiálové vědy o materiálu necitlivém na záření, jako jsou anorganické soli, patří Automatizovaná difrakční tomografie (ADT).[8] a rotační elektronová difrakce (RED[9]). Tyto metody se výrazně liší od MicroED: V ADT diskrétních krocích z goniometr náklon se používá k pokrytí vzájemného prostoru v kombinaci s precesí paprsku k vyplnění mezer.[8] ADT používá specializovaný hardware pro precesi a skenovací transmisní elektronovou mikroskopii pro sledování krystalů.[8] ČERVENÉ se provádí v TEM, ale goniometr je hrubě nakloněn v diskrétních krocích a k vyplnění mezer se používá naklonění paprsku.[9] Ke zpracování dat ADT a RED se používá specializovaný software.[9] Důležité je, že ADT a RED byly vyvinuty a testovány na anorganických materiálech a solích necitlivých na záření a nebyly prokázány pro použití s ​​proteiny nebo organickými materiály citlivými na záření studovanými ve zmrazeném hydratovaném stavu.

Milníky

Rozsah metody

MicroED se používá ke stanovení struktur velkých globulárních proteinů,[10] malé bílkoviny,[2] peptidy,[11] membránové proteiny,[12] organické molekuly,[13][14] a anorganické sloučeniny.[15] V mnoha z těchto příkladů byly pozorovány vodíky a nabité ionty.[11][12]

Nové struktury α-synukleinu u Parkinsonovy choroby

První nové struktury, které MicroED vyřešil, byly zveřejněny koncem roku 2015.[11] Tyto struktury byly z peptidových fragmentů, které tvoří toxické jádro α-synculein, protein zodpovědný za Parkinsonova choroba a vedou k nahlédnutí do toxických agregátů agregačního mechanismu. Struktury byly vyřešeny v rozlišení 1,4 Á.

Nová proteinová struktura R2lox

První nová struktura proteinu vyřešená MicroED byla zveřejněna v roce 2019.[16] Protein je metaloenzym R2 jako ligand vázající oxidáza (R2lox) ze Sulfolobus acidocaldarius. Struktura byla vyřešena při rozlišení 3,0 Á molekulární náhradou pomocí modelu 35% sekvenční identity vytvořeného z nejbližšího homologu se známou strukturou. Tato práce prokázala, že MicroED lze použít k získání neznámé struktury proteinu.

Přístup ke vzdělávání a službám MicroED

Chcete-li se dozvědět více o MicroED, můžete se zúčastnit každoročního kurzu Kurz MicroED Imaging Center na UCLA nebo Kurz MicroED na zdroji diamantového světla . Pro více aktuálních informací o nadcházejících schůzkách a workshopech souvisejících s Kryogenní elektronová mikroskopie metody jako celek, zkontrolujte prosím Stránka 3DEM Meetings and Workshops.

Několik univerzit a společností nabízí služby MicroED, včetně MEDIC - Microcrystal Electron Diffraction Imaging Center at UCLA a Nanoimagingové služby.

Reference

  1. ^ A b C Shi, Dan; Nannenga, Brent L; Iadanza, Matthew G; Gonen, Tamir (2013-11-19). „Trojrozměrná elektronová krystalografie proteinových mikrokrystalů“. eLife. 2: e01345. doi:10,7554 / elife.01345. ISSN  2050-084X. PMC  3831942. PMID  24252878.
  2. ^ A b C d E F Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Leslie, Andrew G W; Gonen, Tamir (03.08.2014). „Stanovení struktury s vysokým rozlišením pomocí sběru dat s kontinuální rotací v MicroED“. Přírodní metody. 11 (9): 927–930. doi:10.1038 / nmeth.3043. ISSN  1548-7091. PMC  4149488. PMID  25086503.
  3. ^ de la Cruz, M. Jason; Hattne, Johan; Shi, Dan; Seidler, Paul; Rodriguez, Jose; Reyes, Francis E; Sawaya, Michael R; Cascio, Duilio; Weiss, Simon C (2017). „Struktury atomového rozlišení z fragmentovaných proteinových krystalů metodou cryoEM MicroED“. Přírodní metody. 14 (4): 399–402. doi:10.1038 / nmeth.4178. ISSN  1548-7091. PMC  5376236. PMID  28192420.
  4. ^ A b Hattne, Johan; Reyes, Francis E .; Nannenga, Brent L .; Shi, Dan; de la Cruz, M. Jason; Leslie, Andrew G. W .; Gonen, Tamir (01.07.2015). „Sběr a zpracování dat MicroED“. Acta Crystallographica oddíl A. 71 (4): 353–360. doi:10.1107 / s2053273315010669. ISSN  2053-2733. PMC  4487423. PMID  26131894.
  5. ^ Nederlof, I .; van Genderen, E .; Li, Y.-W .; Abrahams, J. P. (01.07.2013). „Detektor kvantové oblasti Medipix umožňuje sběr dat rotační elektronové difrakce ze submikrometrických trojrozměrných proteinových krystalů“. Acta Crystallographica oddíl D: Biologická krystalografie. 69 (7): 1223–1230. doi:10.1107 / S0907444913009700. ISSN  0907-4449. PMC  3689525. PMID  23793148.
  6. ^ Shi, Dan; Nannenga, Brent L; de la Cruz, M. Jason; Liu, Jinyang; Sawtelle, Steven; Calero, Guillermo; Reyes, Francis E; Hattne, Johan; Gonen, Tamir (2016-04-14). „Sběr dat MicroED pro makromolekulární krystalografii“. Přírodní protokoly. 11 (5): 895–904. doi:10.1038 / nprot.2016.046. ISSN  1754-2189. PMC  5357465. PMID  27077331.
  7. ^ Viz také https://www.gatan.com/ccd-vs-cmos a https://www.gatan.com/techniques/imaging.
  8. ^ A b C Mugnaioli, E .; Gorelik, T .; Kolb, U. (2009). ""Ab initio „strukturní řešení z dat elektronové difrakce získaných kombinací automatizované difrakční tomografie a precesní techniky“. Ultramikroskopie. 109 (6): 758–765. doi:10.1016 / j.ultramic.2009.01.011. ISSN  0304-3991. PMID  19269095.
  9. ^ A b C Wan, Wei; Sun, Junliang; Su, Jie; Hovmöller, Sven; Zou, Xiaodong (15.11.2013). „Trojrozměrná rotace elektronové difrakce: softwareRED pro automatizovaný sběr a zpracování dat“. Journal of Applied Crystallography. 46 (6): 1863–1873. doi:10.1107 / s0021889813027714. ISSN  0021-8898. PMC  3831301. PMID  24282334.
  10. ^ Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Hattne, Johan; Reyes, Francis E; Gonen, Tamir (10.10.2014). "Struktura katalázy určená MicroED". eLife. 3: e03600. doi:10,7554 / elife.03600. ISSN  2050-084X. PMC  4359365. PMID  25303172.
  11. ^ A b C Rodriguez, J. A.; Ivanova, M .; Sawaya, M.R .; Cascio, D .; Reyes, F .; Shi, D .; Johnson, L .; Guenther, E .; Sangwan, S. (09.09.2015). „MicroED struktura segmentu, GVVHGVTTVA, z A53T familiární mutant proteinu Parkinsonovy choroby, zbytky alfa-synukleinu 47-56“. doi:10,2210 / pdb4znn / pdb. Citovat deník vyžaduje | deník = (Pomoc)
  12. ^ A b Liu, S .; Gonen, T. (12. 9. 2018). "MicroED struktura iontového kanálu NaK odhaluje proces rozdělení Na + do selektivního filtru". doi:10,2210 / pdb6cpv / pdb. Citovat deník vyžaduje | deník = (Pomoc)
  13. ^ Gallagher-Jones, Marcus; Glynn, Calina; Boyer, David R .; Martynowycz, Michael W .; Hernandez, Evelyn; Miao, Jennifer; Zee, Chih-Te; Novikova, Irina V .; Goldschmidt, Lukasz (2018-01-15). „Sub-ångströmská kryo-EM struktura prionového protofibrilu odhaluje polární sponu“. Přírodní strukturní a molekulární biologie. 25 (2): 131–134. doi:10.1038 / s41594-017-0018-0. ISSN  1545-9993. PMC  6170007. PMID  29335561.
  14. ^ Jones, Christopher; Martynowycz, M; Hattne, Johan; Fulton, Tyler J .; Stoltz, Brian M .; Rodriguez, Jose A .; Nelson, Ozeáš; Gonen, Tamir (2018). „Metoda CryoEM MicroED jako výkonný nástroj pro stanovení struktury malých molekul“ (PDF). doi:10.26434 / chemrxiv.7215332.v1. Citovat deník vyžaduje | deník = (Pomoc)
  15. ^ Vergara, Sandra; Lukes, Dylan A .; Martynowycz, Michael W .; Santiago, Ulises; Villa Plascencia, Germán; Weiss, Simon C .; de la Cruz, M. Jason; Black, David M .; Alvarez, Marcos M. (2017-10-31). „Struktura MicroED Au146 (p-MBA) 57 při subatomárním rozlišení odhaluje partnerský klastr FCC“. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (22): 5523–5530. doi:10.1021 / acs.jpclett.7b02621. ISSN  1948-7185. PMC  5769702. PMID  29072840.
  16. ^ Xu, Hongyi; Lebrette, Hugo; Clabbers, Max T. B .; Zhao, Jingjing; Griese, Julia J .; Zou, Xiaodong; Högbom, Martin (7. srpna 2019). "Řešení nové struktury proteinu R2lox pomocí mikrokrystalické elektronové difrakce". Vědecké zálohy. 5 (8): eaax4621. doi:10.1126 / sciadv.aax4621.

Další čtení