Elektronová kryotomografie - Electron cryotomography

Toto schéma ukazuje koncept elektronové tomografie. Vzorek je zobrazen v TEM, když je nakloněn do různých úhlů, což má za následek „sérii naklonění“ 2D obrázků (nahoře). Tato nakloněná řada je poté výpočetně rekonstruována do 3D „tomogramu“ (dole).

Elektronová kryotomografie (KryoET) je zobrazovací technika používaná k výrobě trojrozměrných pohledů na vzorky s vysokým rozlišením (~ 1–4 nm), obvykle biologických makromolekuly a buňky.[1][2] CryoET je specializovaná aplikace kryomikroskopie transmisních elektronů (CryoTEM), ve kterém jsou vzorky zobrazeny při naklonění, což vede k sérii 2D obrazů, které lze kombinovat a vytvořit 3D rekonstrukci, podobnou CT vyšetření lidského těla. Na rozdíl od ostatních elektronová tomografie technikami jsou vzorky imobilizovány v nekrystalickém („sklivcovém“) ledu a zobrazeny pod kryogenní podmínky (<-150 ° C), což umožňuje jejich zobrazení bez dehydratace nebo chemické fixace, které by jinak mohly narušit nebo narušit biologické struktury.[3][4]

Popis techniky

Příklad elektronové kryotomografie. Obrázek ukazuje centrální řez prostřednictvím tomografické rekonstrukce neporušeného Bdellovibrio bakteriovorus buňka. Měřítko 200 nm.

v elektronová mikroskopie (EM) jsou vzorky zobrazeny ve velmi vysokém vakuu. Takové vakuum je nekompatibilní s biologickými vzorky, jako jsou buňky; voda by vařila a rozdíl v tlaku by explodoval buňku. U EM technik při teplotě místnosti se proto vzorky připravují fixací a dehydratací. Dalším způsobem stabilizace biologických vzorků je však jejich zmrazení (elektronová kryomikroskopie ). Stejně jako v jiných technikách elektronové kryomikroskopie, vzorky pro CryoET (obvykle malé buňky (např. Bakterie, Archaea nebo viry ) se připravují ve standardním vodném médiu a aplikují se na EM mřížku. Mřížka se poté ponoří do kryogenu (obvykle etan ) tak efektivní, že voda molekuly nemáte čas na přeskupení do a krystalický mříž.[3] Výsledný vodní stav se nazývá „sklovitý led“ a zachovává původní buněčné struktury, jako např lipidové membrány, které by normálně byly zničeny zmrazením. Ponorné zmrazené vzorky jsou následně uloženy a zobrazeny na tekutý dusík teploty tak, aby se voda nikdy dostatečně neohřála, aby krystalizovala.

Vzorky jsou zobrazeny v a transmisní elektronový mikroskop (TEM). Jako v jiných elektronová tomografie technikami je vzorek nakloněn do různých úhlů vzhledem k elektronovému paprsku (obvykle každý 1 nebo 2 stupně od přibližně -60 ° do + 60 °) a obraz je získán v každém úhlu. Tuto nakloněnou sérii obrazů lze poté výpočetně rekonstruovat do trojrozměrného pohledu na předmět zájmu.[5] Tomu se říká tomogram nebo tomografická rekonstrukce.

Aplikace

v transmisní elektronová mikroskopie (TEM), protože elektrony silně interagují s hmotou, rozlišení je omezeno tloušťkou vzorku. Tloušťka vzorku se také zvyšuje s nakloněním vzorku a tlustší vzorky pak mohou úplně blokovat elektronový paprsek, takže obraz je tmavý nebo zcela černý. Proto by pro CryoET měly mít vzorky tloušťku menší než ~ 500 nm, aby bylo dosaženo „makromolekulárního“ rozlišení (~ 4 nm). Z tohoto důvodu se většina studií ECT zaměřila na purifikované makromolekulární komplexy, viry nebo malé buňky, jako jsou ty mnoha druhů bakterií a archaeí.[1]

Větší buňky a dokonce i tkáně lze pro CryoET připravit ředěním, a to buď kryořezáním, nebo zaostřený iontový paprsek (FIB) frézování. Při kryořezání se zmrazené bloky buněk nebo tkáně rozřezávají na tenké vzorky pomocí kryomikrotom.[6] Při FIB mletí jsou ponorné zmrazené vzorky vystaveny zaostřenému paprsku iontů, obvykle galia, který přesně odřezává materiál z horní a dolní části vzorku a zanechává tenkou lamelu vhodnou pro zobrazování ECT.[7]

Silná interakce elektronů s hmotou má také za následek účinek anizotropního rozlišení. Jak je vzorek během zobrazování nakloněn, elektronový paprsek interaguje s relativně větší plochou průřezu při vyšších úhlech naklonění. V praxi úhly náklonu větší než přibližně 60–70 ° nepřinášejí mnoho informací, a proto se nepoužívají. To má za následek „chybějící klín“ informací ve finálním tomogramu, který snižuje rozlišení paralelně s elektronovým paprskem.[5]

U struktur, které jsou přítomny ve více kopiích v jednom nebo více tomogramech, lze dosáhnout vyššího rozlišení (dokonce i ≤ 1 nm) průměrováním subtomogramu.[8][9] Podobný analýza jednotlivých částic, subtomogram zprůměrováním výpočetně kombinuje obrazy identických objektů a zvyšuje tak odstup signálu od šumu.

Hlavní překážkou v CryoET je identifikace struktur zájmu v komplikovaných celulárních prostředích. Jedním z řešení je použití korelovaného kryo-mikroskopie fluorescenčního světla,[10] a dokonce i světelná mikroskopie s vysokým rozlišením (např. cryo-PALM[11]) a CryoET. V těchto technikách je vzorek obsahující požadovaný fluorescenčně značený protein zmražen a nejprve zobrazen ve světelném mikroskopu vybaveném speciálním stolem, který umožňuje udržovat vzorek při subkrystalizačních teplotách (<-150 ° C). Umístění fluorescenční signál je identifikován a vzorek je přenesen do CryoTEM, kde je poté CryoET zobrazeno stejné místo ve vysokém rozlišení.

Viz také

Reference

  1. ^ A b Gan, Lu; Jensen, Grant J. (2012-02-01). "Elektronová tomografie buněk" (PDF). Čtvrtletní recenze biofyziky. 45 (1): 27–56. doi:10.1017 / S0033583511000102. ISSN  1469-8994. PMID  22082691.
  2. ^ Dodonova, Svetlana O; Aderhold, Patrick; Kopp, Juergen; Ganeva, Iva; Röhling, Simone; Hagen, Wim JH; Sinning, Irmgard; Wieland, Felix; Briggs, John A G (2017-06-16). „Struktura 9Å pláště COPI odhaluje, že Arf1 GTPáza zabírá dvě kontrastní molekulární prostředí“. eLife. 6. doi:10,7554 / eLife.26691. ISSN  2050-084X. PMC  5482573. PMID  28621666.
  3. ^ A b Dubochet, J .; Adrian, M .; Chang, J. J .; Homo, J. C .; Lepault, J .; McDowall, A. W .; Schultz, P. (01.05.1988). „Kryoelektronová mikroskopie vitrifikovaných vzorků“ (PDF). Čtvrtletní recenze biofyziky. 21 (2): 129–228. doi:10.1017 / s0033583500004297. ISSN  0033-5835. PMID  3043536.
  4. ^ Oikonomou, CM; Jensen, GJ; Chang, YW (duben 2016). „Nový pohled na biologii prokaryotických buněk z elektronové kryotomografie“. Recenze přírody. Mikrobiologie. 14 (4): 205–20. doi:10.1038 / nrmicro.2016.7. PMC  5551487. PMID  26923112.
  5. ^ A b Lučič, Vladan; Rigort, Alexander; Baumeister, Wolfgang (08.08.2013). „Kryoelektronová tomografie: výzva provádět strukturní biologii in situ“. The Journal of Cell Biology. 202 (3): 407–419. doi:10.1083 / jcb.201304193. ISSN  1540-8140. PMC  3734081. PMID  23918936.
  6. ^ Al-Amoudi, Ashraf; Chang, Jiin-Ju; Leforestier, Amélie; McDowall, Alasdair; Salamin, Laurée Michel; Norlén, Lars P. O .; Richter, Karsten; Blanc, Nathalie Sartori; Studer, Daniel (15. 9. 2004). "Kryoelektronová mikroskopie sklivcových řezů". Časopis EMBO. 23 (18): 3583–3588. doi:10.1038 / sj.emboj.7600366. ISSN  0261-4189. PMC  517607. PMID  15318169.
  7. ^ Villa, Elizabeth; Schaffer, Miroslava; Plitzko, Jürgen M .; Baumeister, Wolfgang (01.10.2013). „Otevírání oken do buňky: frézování zaměřeným iontovým paprskem pro kryo-elektronovou tomografii“. Aktuální názor na strukturní biologii. 23 (5): 771–777. doi:10.1016 / j.sbi.2013.08.006. ISSN  1879-033X. PMID  24090931.
  8. ^ Briggs, John A. G. (2013-04-01). "Strukturní biologie in situ - potenciál průměrování subtomogramu". Aktuální názor na strukturní biologii. 23 (2): 261–267. doi:10.1016 / j.sbi.2013.02.003. ISSN  1879-033X. PMID  23466038.
  9. ^ Schur, Florian K. M .; Dick, Robert A .; Hagen, Wim J. H .; Vogt, Volker M .; Briggs, John A. G. (2015-10-15). „Struktura nezralých virů podobných částic viru gagů Rous Sarcoma odhaluje strukturální roli domény p10 v sestavě“. Journal of Virology. 89 (20): 10294–10302. doi:10.1128 / JVI.01502-15. ISSN  1098-5514. PMC  4580193. PMID  26223638.
  10. ^ Zhang, Peijun (01.10.2013). „Korelační kryoelektronová tomografie a optická mikroskopie buněk“. Aktuální názor na strukturní biologii. 23 (5): 763–770. doi:10.1016 / j.sbi.2013.07.017. ISSN  1879-033X. PMC  3812453. PMID  23962486.
  11. ^ Chang, Yi-Wei; Chen, Songye; Tocheva, Elitza I .; Treuner-Lange, Anke; Löbach, Stephanie; Søgaard-Andersen, Lotte; Jensen, Grant J. (01.07.2014). „Korelovaná kryogenní fotoaktivovaná lokalizační mikroskopie a kryoelektronová tomografie“. Přírodní metody. 11 (7): 737–739. doi:10.1038 / nmeth.2961. ISSN  1548-7105. PMC  4081473. PMID  24813625.

externí odkazy