Surveyor nukleázový test - Surveyor nuclease assay

Schéma pracovního postupu průzkumné nukleázy

Surveyor nukleázový test je test štěpení nesouladu enzymů používaný k detekci neshody jedné základny nebo malé vložení nebo odstranění (indels ).

Surveyorova nukleáza je součástí rodiny neshodné endonukleázy které byly objeveny v celeru (nukleázy CEL).[1] Enzym rozpoznává všechny základní substituce a inzerce / delece a s vysokou specificitou štěpí 3 'stranu nesouladných míst v obou řetězcích DNA[2]

Tento test byl použit k identifikaci a analýze mutací v různých organismech a typech buněk, stejně jako k potvrzení modifikací genomu po úpravě genomu (pomocí CRISPR /TALEN /zinkové prsty ).

Pozadí

Schopnost objevovat a detekovat známé a neznámé mutace má velký význam v biomedicínském výzkumu a genetické diagnostice (viz Aplikace). Proto bylo vyvinuto několik metod umožňujících výzkumnou a klinickou diagnostickou detekci takových mutací.

Nejpřímější způsob, jak identifikovat změny / rozdíly v sekvenci, je čtení sekvence DNA pomocí tradičních a vysoce výkonných metod sekvenování DNA (viz Sangerovo sekvenování a Sekvenování DNA ). Tyto metody však poskytují velké množství nepotřebných dat a jejich použití je nákladné.[3] Navíc tradiční sekvenování může být užitečné pro detekci zárodečných mutací, ale může být méně úspěšné při detekci somatických vedlejších alel při nízkých frekvencích (mozaicismus ). Proto jsou k detekci mutace nebo polymorfismu zapotřebí další přístupy, které nejsou založeny na sekvenování.

Další široce používané metody závisí na fyzikálních vlastnostech DNA, například systémy založené na teplotě tání jako např Jednovláknový konformační polymorfismus analýza (SSCP) a Denaturační vysoce účinná kapalinová chromatografie (DHPLC). Tyto techniky jsou obecně omezeny na analýzu krátkých fragmentů DNA (<1 000 bp) a jsou schopny indikovat pouze přítomnost polymorfismu (ů), ale neumožňují snadno lokalizaci mutace v sekvenci DNA. Proto je nutné dodržovat další techniky, aby bylo možné přesně určit mutaci nebo zmapovat více mutací ve stejném fragmentu.[3]

Testy štěpení enzymovým nesouladem využívají vlastnosti nespecifických endonukleáz k detekci a štěpení nesouladů. Tyto metody lze snadno spustit pomocí standardních laboratorních technik a vybavení a mohou detekovat polymorfismy, neshody párů párů bází a inzerce a delece při nízkých frekvencích.[4] Bylo objeveno několik takových enzymů (včetně CEL I, T4 endonukleázy VII, Endonukleázy V, T7 endonukleázy I).[3]

Jedním z běžně používaných enzymů je Surveyorova nukleáza (CEL II), která štěpí 3 'stranu obou řetězců DNA s vysokou specificitou v místech základní substituce nebo inzerce / delece. Tento enzym je schopen štěpit při více mutacích ve velkých fragmentech DNA a produkuje detekovatelné produkty štěpení z neshody DNA představující pouze malou část DNA v populaci, takže je vhodný pro použití v testech štěpení shody enzymu.[2]

Dějiny

V roce 1998 Olekowski a kol.[5] identifikovali novou neshodou specifickou endonukleázu. Enzym byl čištěn z celeru a dostal název CEL I.

Ukázalo se, že CEL I štěpí DNA s vysokou specificitou na obou vláknech na 3 'straně neshody bázových substitucí, a lze jej proto použít v metodách detekce enzymových mutací k identifikaci mutací a polymorfismů. Olekowski a kolegové demonstrovali tuto techniku ​​pomocí tohoto enzymu k detekci různých mutací a polymorfismů v lidském genu BRCA1.[1][5][6]

Při monitorování čištění CEL I pomocí elektroforéza na polyakrylamidovém gelu Yang a kol.[1] si všiml, že existují dva nukleázové pásy, které zůstaly pohromadě během všech kroků čištění. Hlavní aktivita nukleázy byla označena CEL I, zatímco vedlejší aktivita na SDS-PAGE byla pojmenována CEL II. Došli k závěru, že CEL I a CEL II jsou podobné a že oba jsou schopni štěpit nesoulad DNA.

V roce 2004 Qiu et al. vyvinul technologii detekce mutací založenou na CEL II, známou také jako Surveyor Nuclease.[2] Od té doby se metoda používá k detekci mutací a polymorfismů v mnoha různých organismech a typech buněk (viz aplikace).

Surveyorova nukleáza byla licencována od Fox Chase Cancer Center podle Transgenomic, Inc. a následně byl prodán společnosti IDT, který ji v současné době distribuuje.

Pracovní postup analýzy nukleázového průzkumu

Extrakce DNA

Zpočátku zájmová DNA (jaderná nebo mitochondriální DNA ) se extrahuje z tkání nebo buněčné kultury. Toho lze dosáhnout standardními extrakčními metodami, jako je štěpení proteinázou K následované srážením ethanolem nebo jinými komerčně dostupnými způsoby.

Pokud se předpokládá, že DNA bude heterogenní, např. ze skupiny odlišně modifikovaných buněk nebo z nosičů heterozygotních mutací není nutné přidávat kontrolní DNA.

Polymerázová řetězová reakce

Oblast zájmu jak v mutantní, tak v referenční DNA divokého typu je amplifikována pomocí polymerázová řetězová reakce (PCR). PCR reakce by měla být prováděna s použitím vysoce věrné korektury polymerázy, aby se zabránilo zavedení chyb PCR, které budou interpretovány nukleázou. PCR reakce by měla být optimalizována tak, aby vytvořila jeden silný pás PCR, protože nespecifické pásy zvýší Hluk v pozadí testu.

Pokud se předpokládá přítomnost alely zájmu v nízké frekvenci, například v případě somatické mozaicismus nebo heteroplazmatická mitochondriální DNA, lze uvažovat o modifikovaném protokolu PCR, který obohacuje variantní alely ze směsi DNA divokého typu a DNA obsahující mutace (např. STUDENÉ PCR ).

Tvorba hybridního DNA duplexu

Požadovaná DNA je denaturována a žíhána, aby se vytvořily heteroduplexy obsahující nesoulad v místě mutace, který lze poté identifikovat pomocí nukleázy Surveyor. Pokud se předpokládá, že DNA bude homogenní (např. Homoplazmatická mitochondriální DNA nebo identické alely na obou chromozomech genomové DNA), pak je potřeba DNA z kontrolního vzorku, aby se vytvořil heteroduplex, který je pak rozpoznatelný nukleázou. Pokud je vzorek DNA heterogenní, není nutná žádná další kontrolní DNA; produkty PCR by však měly být stále denaturovány a žíhány, aby se vytvořily heteroduplexy.

Trávení

Žíhaná DNA je ošetřena nukleázou Surveyor, aby se štěpily heteroduplexy. Všechny typy nesouladů jsou identifikovatelné nukleázou Surveyor, i když preference pro snížení nesouladu spadají do čtyř skupin od nejvíce po nejméně preferované: CT, AC a CC jsou upřednostňovány stejně jako TT, následovány AA a GG a nakonec následovány nejméně preferovanými , AG a GT. Kontext sekvence také ovlivňuje rychlost digesce nukleáz Surveyor.[2]

Analýza

Produkty štěpené DNA lze analyzovat pomocí konvenční gelové elektroforézy nebo kapilární elektroforézy s vysokým rozlišením. Detekce rozštěpených produktů naznačuje přítomnost heteroduplexu tvořeného nesouladem. Umístění mutace / polymorfismu lze odvodit pozorováním délky fragmentu po štěpení. Pokud se k označení 5 'a 3' konce produktů PCR použijí fluorescenčně značené primery, budou při analýze pozorovány různě zbarvené pruhy. Velikost každého pásma nezávisle potvrzuje polohu mutace / polymorfismu. Více mutací lze detekovat přítomností několika fragmentů.[1][5]

Výhody a omezení

Výhody

Výhody nesouladu nukleázových testů

Jednou z hlavních výhod detekce mutací a polymorfismů pomocí metod nesouladu nukleáz je, že nejsou vyžadovány žádné předchozí znalosti týkající se povahy mutace, na rozdíl od jiných metod, jako je polymorfismy délky restrikčních fragmentů (RFLP), který byl v minulosti používán pro analýzu SNP.

Ve srovnání s metodami založenými na teplotě tání jsou metody nespecifické endonukleázy nejen rychlejší, ale mohou také detekovat více mutací ve velkých fragmentech DNA.

Tuto metodu je možné použít ve vysoce výkonných systémech využívajících automatizované vstřikování, takže je vhodná pro screening.[7]

Výhody geodetické nukleázy

Surveyorova nukleáza je přiměřeně citlivý enzym, který produkuje detekovatelné produkty štěpení ze sekvencí představujících pouze malou část DNA v populaci. Může detekovat poměr 1:32 heteroduplexu k homoduplexu pro menší produkty PCR (~ 0,6 kb) a 1:16 heteroduplexu k homoduplexu pro delší produkty PCR (~ 2,3 kb). Tato vlastnost umožňuje bazén klinické vzorky, aby se zvýšila tvorba heteroduplexu a tím i citlivost.[3] To je také užitečné pro detekci menších variant v heterogenní populaci (jako je heterogenní nádor). V případě úpravy genomu pomocí CRISPR nebo jinými metodami může tato vlastnost zlepšit detekci vzácných editačních událostí v populaci buněk před vytvořením a testováním jednotlivých upravených klonů.

Geodetická nukleáza štěpí všechny typy nesouladů, i když některé jsou výhodnější než jiné: CT, AC a CC jsou upřednostňovány stejně jako TT, následovány AA a GG a nakonec následovány nejméně preferovanými, AG a GT. Také detekuje Indels až nejméně 12 bp.[2]

Surveyor nukleasový test může také detekovat více mutací ve stejném fragmentu. To však vyžaduje několik dalších kroků zpracování, které mohou také zvýšit pozadí testu (viz Omezení).

Omezení

Produkt amplifikace PCR

Jedním z hlavních omezení tohoto testu je to, že se spoléhá na PCR amplifikaci, a je proto ovlivněn kvalitou amplifikovaného produktu. Artefakty PCR (např. Primer-dimery nebo zkrácené produkty) mohou zvýšit hluk pozadí a zakrýt signál. Primer-dimery mohou také inhibovat aktivitu geodetické nukleázy a snižovat tak signál.

Protože metoda PCR má potenciál zavést během amplifikace své vlastní mutace, mohou tyto chyby také zvýšit šum pozadí. Proto je nejlepší použít vysoce přesnou polymerázu k minimalizaci chyb amplifikace.

Analýza mitochondriální DNA může být náchylná ke kontaminaci sekvencemi nukleární mitochondriální DNA společně amplifikovanými během reakce PCR, což zkresluje analýzu homoplazmatické versus heteroplazmatické mitochondriální DNA.[8]

Aby bylo možné detekovat více mutací ve stejném fragmentu, musí být před štěpením nukleázou Surveyor provedeno čištění po PCR. Detekci více neshod lze také zlepšit zvýšením času a množství geodetické nukleázy v reakci, ale to také zvyšuje pozadí kvůli nespecifickému štěpení.

Omezení průzkumového nukleázového enzymu

Surveyorova nukleáza má také 5 'exonukleázovou aktivitu, která útočí na konce dvouvláknové DNA a zvyšuje signál pozadí během prodloužené inkubace.[2] To lze snížit zkrácením doby trávení a přidáním DNA polymerázy.

Aplikace

Potvrzení modifikací genomu pomocí CRISPR a dalších metod

V posledních letech se objevila řada technologií pro úpravu genomu, včetně nukleázy se zinkovým prstem (ZFN), transkripční aktivátorové efektorové nukleázy (TALEN ) a naváděná RNA CRISPR / Cas9 nukleázový systém. Tyto metody podporují editaci genomu zavedením dvouřetězcového zlomu DNA, po kterém následuje oprava prostřednictvím nehomologních konců spojujících konce (NHEJ) nebo homologně řízených oprav (HDR). Zatímco se očekává, že HDR zavede konzistentní modifikaci genomu, NHEJ může zavést heterogenní směs mutací (obvykle malé indely), kterou bude obtížné identifikovat pomocí Sangerova sekvenování. Bodové mutace a indely mohou být detekovány geodetickým testem inspektora, takže je užitečné detekovat editaci genomu ve skupině buněk bez nutnosti klonální expanze před analýzou a může také poskytnout odhad dosažené účinnosti cílení.[9][10][11] I po klonální expanzi může být detekce mutací pomocí Sangerovy sekvence obtížná, protože každá alela může podstoupit jinou editační událost. V tomto případě bude Surveyorova nukleázová zkouška tento efekt skutečně využívat k vytvoření požadovaných heteroduplexů pro detekci nesouladnou endonukleázou.

Detekce zárodečných mutací v lidských genech

K detekci byl použit testovací nukleázový test zárodečné mutace v lidských genech. Například ATRX pro mentální retardaci vázanou na X,[12] a gen HBB spojený s β-thalasémií.[7] Stanovení bylo také použito k detekci mitochondriálních a nukleárních DNA mutací spojených s defekty dýchacího řetězce,[13] a mutace spojené s onemocněním ledvin.[14][15]

Detekce somatických mutací u rakoviny

K detekci byl použit testovací nukleázový test somatické mutace v různých geny související s rakovinou, a jak je uvedeno výše, lze použít, i když je vzorek heterogenní a mutovaná alela tvoří pouze 1% –5% z celkových alel.[16] Tato metoda byla použita k detekci mutací v receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR),[16][17][18][19] Janus Kinase 2 (JAK2),[20][21] p53 [22] a další.

Další aplikace

Metoda byla použita k detekci mutací, které způsobují rezistenci na léky u Mycobacterium tuberculosis.[23]

Reference

  1. ^ A b C d Yang, B .; Wen, X .; Kodali, N. S .; Oleykowski, C. A .; Miller, C. G .; Kulinski, J .; Besack, D .; Yeung, J. A .; Kowalski, D. (04.04.2000). "Čištění, klonování a charakterizace nukleázy CEL I". Biochemie. 39 (13): 3533–3541. doi:10.1021 / bi992376z. ISSN  0006-2960. PMID  10736152.
  2. ^ A b C d E F Qiu, Peter; Shandilya, Harini; D'Alessio, James M .; O'Connor, Kevin; Durocher, Jeffrey; Gerard, Gary F. (04.04.2004). „Detekce mutací pomocí nukleázy Surveyor“. Biotechniky. 36 (4): 702–707. doi:10.2144 / 04364PF01. ISSN  0736-6205. PMID  15088388.
  3. ^ A b C d Yeung, Anthony T .; Hattangadi, Deepali; Blakesley, Lauryn; Nicolas, Emmanuelle (2005-05-01). „Technologie detekce enzymových mutací“. Biotechniky. 38 (5): 749–758. doi:10.2144 / 05385rv01. ISSN  0736-6205. PMID  15948293.
  4. ^ Huang, Mo Chao; Cheong, Wai Chye; Lim, Li Shi; Li, Mo-Huang (01.03.2012). "Jednoduchý, vysoce citlivý screening mutací pomocí ampligázy zprostředkované T7 endonukleázy I a nukleázy Surveyor s mikrofluidní kapilární elektroforézou". Elektroforéza. 33 (5): 788–796. doi:10.1002 / elps.201100460. ISSN  1522-2683. PMID  22437793.
  5. ^ A b C Oleykowski, Catherine A .; Mullins, Colleen RB; Godwin, Andrew K; Yeung, Anthony T (1998). „Detekce mutací pomocí nové rostlinné endonukleázy“. Výzkum nukleových kyselin. 26 (20): 4597–4602. doi:10.1093 / nar / 26.20.4597. PMC  147896. PMID  9753726.
  6. ^ Kulinski, J .; Besack, D .; Oleykowski, C. A .; Godwin, A. K .; Yeung, A. T. (2000-07-01). „Stanovení enzymatické mutace CEL I“. Biotechniky. 29 (1): 44–46, 48. doi:10.2144 / 00291bm07. ISSN  0736-6205. PMID  10907074.
  7. ^ A b Hung, Chia-Cheng; Su, Yi-Ning; Lin, Chia-Yun; Chang, Yin-Fei; Chang, Chien-Hui; Cheng, Wen-Fang; Chen, Chi-An; Lee, Chien-Nan; Lin, Win-Li (01.01.2008). „Srovnání metody neshodné specifické endonukleázy a denaturační vysoce výkonné kapalinové chromatografie pro identifikaci mutací genu HBB“. BMC biotechnologie. 8: 62. doi:10.1186/1472-6750-8-62. ISSN  1472-6750. PMC  2525636. PMID  18694524.
  8. ^ Yen, Hsiu-Chuan; Li, Shiue-Li; Hsu, Wei-Chien; Tang, Petrus (01.01.2014). „Interference Co-amplifikovaných jaderných mitochondriálních sekvencí DNA při stanovení lidské mtDNA heteroplazmy pomocí nukleázy SURVEYOR a systému WAVE HS“. PLOS ONE. 9 (3): e92817. Bibcode:2014PLoSO ... 992817Y. doi:10.1371 / journal.pone.0092817. ISSN  1932-6203. PMC  3963942. PMID  24664244.
  9. ^ Guschin, Dmitry Y .; Waite, Adam J .; Katibah, George E .; Miller, Jeffrey C .; Holmes, Michael C .; Rebar, Edward J. (01.01.2010). "Rychlý a obecný test pro monitorování modifikace endogenního genu". Metody v molekulární biologii. 649: 247–256. doi:10.1007/978-1-60761-753-2_15. ISBN  978-1-60761-752-5. ISSN  1940-6029. PMID  20680839.
  10. ^ Ran, F. Ann; Hsu, Patrick D .; Lin, Chie-Yu; Gootenberg, Jonathan S .; Konermann, Silvana; Trevino, Alexandro E .; Scott, David A .; Inoue, Azusa; Matoba, Shogo (12.9.2013). „Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome specific specificity“. Buňka. 154 (6): 1380–1389. doi:10.1016 / j.cell.2013.08.021. ISSN  1097-4172. PMC  3856256. PMID  23992846.
  11. ^ Wang, Haoyi; Yang, Hui; Shivalila, Chikdu S .; Dawlaty, Meelad M .; Cheng, Albert W .; Zhang, Feng; Jaenisch, Rudolf (09.05.2013). „Jednostupňová generace myší nesoucích mutace ve více genech metodou genomu zprostředkovanou CRISPR / Cas“. Buňka. 153 (4): 910–918. doi:10.1016 / j.cell.2013.04.025. ISSN  1097-4172. PMC  3969854. PMID  23643243.
  12. ^ Wada, Takahito; Fukushima, Yoshimitsu; Saitoh, Shinji (2006-07-15). „Nová metoda detekce mutací genu ATRX s použitím nespecifické endonukleázy“. American Journal of Medical Genetics Part A. 140 (14): 1519–1523. doi:10,1002 / ajmg.a.31310. ISSN  1552-4825. PMID  16763962.
  13. ^ Bannwarth, Sylvie; Procaccio, Vincent; Paquis-Flucklinger, Veronique (06.06.2005). „Surveyor Nuclease: nová strategie pro rychlou identifikaci heteroplazmatických mutací mitochondriální DNA u pacientů s defekty dýchacího řetězce“. Lidská mutace. 25 (6): 575–582. doi:10.1002 / humu.20177. ISSN  1098-1004. PMID  15880407.
  14. ^ Tan, Ying-Cai; Blumenfeld, Jon D .; Anghel, Raluca; Donahue, Stephanie; Belenkaya, Rimma; Balina, Marina; Parker, Thomas; Levine, Daniel; Leonard, Debra G. B. (01.02.2009). "Nová metoda pro genomickou analýzu mutací PKD1 a PKD2 u autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin". Lidská mutace. 30 (2): 264–273. doi:10.1002 / humu.20842. ISSN  1098-1004. PMID  18837007.
  15. ^ Voskarides, Konstantinos; Deltas, Constantinos (01.07.2009). "Skríning mutací v genech souvisejících s ledvinami pomocí nukleázy SURVEYOR pro štěpení při neshodách heteroduplexu". The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (4): 311–318. doi:10.2353 / jmoldx.2009.080144. ISSN  1943-7811. PMC  2710707. PMID  19525337.
  16. ^ A b Engelman, Jeffrey A .; Mukohara, Toru; Zejnullahu, Kreshnik; Lifshits, Eugene; Borrás, Ana M .; Gale, Christopher-Michael; Naumov, George N .; Yeap, Beow Y .; Jarrell, Emily (01.10.2006). „Alelické ředění zakrývá detekci biologicky významné mutace rezistence u EGFR-amplifikovaného karcinomu plic“. The Journal of Clinical Investigation. 116 (10): 2695–2706. doi:10,1172 / JCI28656. ISSN  0021-9738. PMC  1570180. PMID  16906227.
  17. ^ Jackman, David M .; Holmes, Alison J .; Lindeman, Neal; Wen, Patrick Y .; Kesari, Santosh; Borras, Ana M .; Bailey, Christopher; de Jong, Francisca; Jänne, Pasi A. (2006-09-20). „Odezva a rezistence u nemalobuněčného pacienta s karcinomem plic s mutací receptoru epidermálního růstového faktoru a leptomeningeálními metastázami léčenými vysokými dávkami gefitinibu.“ Journal of Clinical Oncology. 24 (27): 4517–4520. doi:10.1200 / JCO.2006.06.6126. ISSN  1527-7755. PMID  16983123.
  18. ^ Jackman, David M .; Yeap, Beow Y .; Sequist, Lecia V .; Lindeman, Neal; Holmes, Alison J .; Joshi, Victoria A .; Bell, Daphne W .; Huberman, Mark S .; Halmos, Balazs (01.07.2006). „Deleční mutace exonu 19 receptoru pro epidermální růstový faktor jsou spojeny s prodlouženým přežitím u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic léčených gefitinibem nebo erlotinibem“. Klinický výzkum rakoviny. 12 (13): 3908–3914. doi:10.1158 / 1078-0432.CCR-06-0462. ISSN  1078-0432. PMID  16818686.
  19. ^ Jänne, Pasi A .; Borras, Ana M .; Kuang, Yanan; Rogers, Andrew M .; Joshi, Victoria A .; Liyanage, Hema; Lindeman, Neal; Lee, Jeffrey C .; Halmos, Balazs (2006-02-01). „Rychlá a citlivá enzymatická metoda pro screening mutací receptoru epidermálního růstového faktoru“. Klinický výzkum rakoviny. 12 (3 Pt 1): 751–758. doi:10.1158 / 1078-0432.CCR-05-2047. ISSN  1078-0432. PMID  16467085.
  20. ^ Jamieson, Catriona H. M .; Gotlib, Jason; Durocher, Jeffrey A .; Chao, Mark P .; Mariappan, M. Rajan; Lay, Marla; Jones, Carol; Zehnder, James L .; Lilleberg, Stan L. (2006-04-18). „Mutace JAK2 V617F se vyskytuje v hematopoetických kmenových buňkách v polycythemia vera a předurčuje k diferenciaci erytroidů“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 103 (16): 6224–6229. Bibcode:2006PNAS..103,6224J. doi:10.1073 / pnas.0601462103. ISSN  0027-8424. PMC  1434515. PMID  16603627.
  21. ^ Sattler, Martin; Walz, Christoph; Crowley, Brian J .; Lengfelder, Eva; Jänne, Pasi A .; Rogers, Andrew M .; Kuang, Yanan; Distel, Robert J .; Reiter, Andreas (01.02.2006). „Citlivá vysokovýkonná metoda pro detekci aktivujících mutací Jak2 ve vzorcích periferní krve“. Krev. 107 (3): 1237–1238. doi:10.1182 / krev-2005-07-2899. ISSN  0006-4971. PMC  1895916. PMID  16434495.
  22. ^ Mitani, Noriaki; Niwa, Yoshimasa; Okamoto, Yasuyuki (01.11.2007). "Detektorová nukleázová detekce mutací genu p53 při hematologické malignitě". Annals of Clinical Biochemistry. 44 (Pt 6): 557–559. doi:10.1258/000456307782268174. ISSN  0004-5632. PMID  17961311.
  23. ^ Shi, Ruiru; Otomo, Koji; Yamada, Hiroyuki; Tatsumi, Taiga; Sugawara, Isamu (01.01.2006). „Teplotně zprostředkovaná heteroduplexní analýza pro detekci genových mutací rezistentních na léčiva v klinických izolátech Mycobacterium tuberculosis denaturační HPLC, nukleáza SURVEYOR“. Mikrobi a infekce / Institut Pasteur. 8 (1): 128–135. doi:10.1016 / j.micinf.2005.06.008. ISSN  1286-4579. PMID  16182590.