Denaturační vysoce účinná kapalinová chromatografie - Denaturing high performance liquid chromatography - Wikipedia
 | tento článek ne uvést žádný Zdroje. (Srpna 2014) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) |
Denaturace vysoce výkonné kapalinové chromatografie (DHPLC) je metoda chromatografie pro detekci základních substitucí, malých delecí nebo inzercí v DNA. Díky své rychlosti a vysokému rozlišení je tato metoda zvláště užitečná pro hledání polymorfismy v DNA.
V praxi začíná analýza standardem PCR za účelem zesílení sledovaného fragmentu. Pokud je amplifikovaná oblast vykazující polymorfismus (y) hemizygotní, v produktu PCR budou přítomny dva druhy fragmentů odpovídající alele a divoké polymorfní alele. Po tomto prvním kroku následuje krok denaturace – renaturace k vytvoření hetero- a homoduplexů ze dvou populací alel v PCR. Chcete-li najít homozygotní polymorfismus, postupujte stejným způsobem tak, že předem smícháte divokou populaci DNA s populací polymorfní DNA a po kroku denaturace – renaturace získáte heteroduplexy.
Heteroduplexy jsou ve skutečnosti dvojité řetězce DNA obsahující vlákno z alely divokého typu a větvičku z polymorfní alely. Tvorba takových fragmentů DNA pak způsobí výskyt „neshody“ nebo špatného párování, kde se nachází polymorfismus.
Tyto „neshody“ v heteroduplexu jsou základem pro detekci polymorfismu pomocí DHPLC. Heteroduplexy jsou tepelně méně stabilní než jejich odpovídající homoduplexy a jednotlivé řetězce DNA budou proto odpojeny chromatografií, pokud budou vystaveny dostatečně vysoké teplotě. Důsledkem této nestability dvouřetězců bude nesoulad dvou řetězců DNA v oblasti polymorfismu, když se DNA zahřeje na DNA tání teplota. Tento nesoulad proto sníží interakci s kolonou a bude mít za následek kratší retenční čas ve srovnání s homoduplexy v procesu chromatografické separace.
Ke sledování fenoménu separace používá metoda DHPLC a sloupec nenaroubované porézní stacionární fáze složené z polystyren -divinylbenzen alkyl. Stacionární fáze je elektricky neutrální a hydrofobní. DNA je však na svých fosfátových skupinách záporně nabitá, a proto se může na koloně adsorbovat. Aby bylo možné adsorpce možný, triethylamoniumacetát (TEAA) se používá. Kladně nabitý amonný iont těchto molekul interaguje s DNA a alkylovým řetězcem s hydrofobním povrchem pevné fáze.
Proto, když jsou heteroduplexy částečně denaturovány zahříváním, negativní náboje procházejí částečným přemístěním a interakční síla mezi heteroduplexy DNA a kolonou klesá ve srovnání se silou interakce homoduplexů. Ty budou proto mobilní fází (skládající se z acetonitril ).