Φ29 DNA polymeráza - Φ29 DNA polymerase

Φ29 DNA polymeráza je enzym z bakteriofág Φ29. Stále častěji se používá v molekulární biologie pro amplifikace DNA s vícenásobným posunem postupy a má řadu funkcí, díky nimž je pro tuto aplikaci zvláště vhodný.

Φ29 replikace DNA

Φ29 je bakteriofág Bacillus subtilis se sekvenovaným lineárním genomem DNA 19 285 párů bází.^[1] Každý 5 'konec je kovalentně spojen s terminálním proteinem, který je nezbytný v procesu replikace. Byl navržen symetrický způsob replikace, kdy k iniciaci primem proteinu dochází nesimultánně z kteréhokoli konce chromozomu; to zahrnuje dva počátky replikace a dva odlišné polymerasové monomery. Syntéza je kontinuální a zahrnuje mechanismus posunutí vlákna. To bylo prokázáno schopností enzymu pokračovat v kopírování jednotlivě aktivovaného kruhového genomu fágu M13 více než desetinásobně v jednom řetězci (více než 70 kb v jednom řetězci).^[2]Pokusy in vitro ukázaly, že replikace -29 může pokračovat až do úplného splnění požadavků na jediný fágový protein u polymerázy a terminálního proteinu.^[2]Polymeráza katalyzuje tvorbu iniciačního komplexu mezi koncovým proteinem a chromozomem končí na adeninovém zbytku. Odtud může nastat kontinuální syntéza.

Polymeráza

Polymeráza je a monomerní protein se dvěma odlišnými funkčními doménami. Určeno pro web mutageneze experimenty podporují tvrzení že tento protein vykazuje strukturální a funkční podobnost s Klenowův fragment z Escherichia coli Enzym polymerázy I;^[3] obsahuje C-koncovou polymerázovou doménu a prostorově oddělenou N-koncovou doménu s 3'-5 ' exonukleáza aktivita.

Izolovaný enzym nemá žádnou vnitřní povahu helikáza činnost, ale může provádět ekvivalentní funkci prostřednictvím své silné vazby na jednořetězcová DNA, zvláště přednostně dvouvláknové nukleové kyselině. To je vlastnost tohoto enzymu, pro kterou je příznivě použitelná Zesílení vícenásobného posunutí. Enzym umožňuje „rozvětvení“ dvouvláknové DNA.^[2] Deoxyribonukleosid trifosfát štěpení, ke kterému dochází jako součást polymeračního procesu, pravděpodobně dodává energii potřebnou pro tento odvíjecí mechanismus.^[4] Kontinuální povaha syntézy vlákna (ve srovnání s asymetrickou syntézou pozorovanou u jiných organismů) pravděpodobně přispívá k této zvýšené procesivitě. exonukleáza Doména byla prokázána ukázkou preferenční excize neodpovídajícího nukleotidu z 3 'konec nově syntetizovaného řetězce.^[5] Exonukleázová aktivita enzymu je, stejně jako jeho polymerační aktivita, vysoce procesní a může degradovat jednovláknové oligonukleotidy bez disociace. Spolupráce nebo „choulostivá soutěž“ mezi těmito dvěma funkčními doménami je nezbytná, aby bylo zajištěno přesné prodloužení při optimální rychlosti. Aktivita exonukleázy enzymu brání jeho polymerační kapacitě; inaktivace exonukleázové aktivity místně cílenou mutagenezí znamená, že k dosažení stejných rychlostí prodloužení primeru, jaké lze pozorovat u divoký typ enzym.^[5]

Zesílení celého genomu

Enzym Φ29 polymerázy se již používá v zesílení vícenásobného posunutí (MDA) postupy (včetně řady komerčních souprav), přičemž fragmenty o délce desítek kilobází mohou být produkovány z nespecifických hexamerních primerů žíhajících v intervalech podél genomu. Enzym má mnoho žádoucích vlastností, díky nimž je vhodný amplifikace celého genomu (WGA) touto metodou.^[6]

• Vysoká procesivita.^[2]
• Korekturní činnost.^[5] Předpokládá se, že je o 1 nebo 2 řády méně náchylný k chybám než Taq polymeráza.^[7]
• Generuje velké fragmenty, více než 10 kB.
• Produkuje více DNA než metody založené na PCR, a to zhruba o řád.^[8]
• Vyžaduje minimální množství šablony; 10 ng stačí.
• Nový mechanismus replikace; zesílení posunutí více pramenů.
  • Náhodný primery Lze použít (hexamery), není třeba navrhovat specifické primery / cílit na konkrétní oblasti.
  • Není třeba tepelné cyklování.
• Dobré pokrytí a snížené zkreslení amplifikace ve srovnání s přístupy založenými na PCR. Spekuluje se, že jde o nejméně předpojatou metodu WGA, která se používá.^[8]

Reference

Další čtení

• Linck L, Resch-Genger U (2010). "Identifikace účinných fluoroforů pro přímé značení DNA pomocí polymerázy φ29 s amplifikací kolečka (RCA)". Eur J Med Chem. 45 (12): 5561–6. doi:10.1016 / j.ejmech.2010.09.005. PMID  20926164.
• de Vega M, Lázaro JM, Mencía M, Blanco L, Salas M (2010). „Zlepšení výkonu amplifikace φ29 DNA polymerázy fúzí motivů vázajících DNA“. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38): 16506–11. doi:10.1073 / pnas.1011428107. PMC  2944734. PMID  20823261.
• Pérez-Arnaiz P, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2010). „phi29 DNA polymerase active site: role of residual Val250 as metal-dNTP complex ligand and in protein-primed initialization“. J Mol Biol. 395 (2): 223–33. doi:10.1016 / j.jmb.2009.10.061. PMID  19883660.
• Pérez-Arnaiz P, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2009). "Funkční význam bakteriofágového phi29 DNA polymerázového zbytku Tyr148 při stabilizaci primeru na konci na aktivním místě 3'-5 'exonukleázy". J Mol Biol. 391 (5): 797–807. doi:10.1016 / j.jmb.2009.06.068. PMID  19576228.
• Johne R, Müller H, rektor A, van Ranst M, Stevens H (2009). "Kruhová amplifikace virových DNA genomů pomocí phi29 polymerázy". Trends Microbiol. 17 (5): 205–11. doi:10.1016 / j.tim.2009.02.004. PMID  19375325.
• Lagunavicius A, Merkiene E, Kiveryte Z, Savaneviciute A, Zimbaite-Ruskuliene V, Radzvilavicius T, Janulaitis A (2009). „Nová aplikace DNA29 polymerázy Phi29: detekce a analýza RNA in vitro a in situ pomocí cílového RNA primovaného RCA“. RNA. 15 (5): 765–71. doi:10.1261 / rna.1279909. PMC  2673074. PMID  19244362.
• Rodríguez I, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2009). „Zapojení pohybu subdomény TPR2 do aktivit phi29 DNA polymerázy“. Nucleic Acids Res. 37 (1): 193–203. doi:10.1093 / nar / gkn928. PMC  2615600. PMID  19033368.
• Sahu S, LaBean TH, Reif JH (2008). "Zařízení pro nanotransport DNA využívající polymerázu phi29". Nano Lett. 8 (11): 3870–8. CiteSeerX  10.1.1.151.6316. doi:10.1021 / nl802294d. PMID  18939810.
• Xu Y, Gao S, Bruno JF, Luft BJ, Dunn JJ (2008). „Rychlá detekce a identifikace DNA patogenu pomocí DNA29 polymerázy Phi29“. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375 (4): 522–5. doi:10.1016 / j.bbrc.2008.08.082. PMC  2900840. PMID  18755142.
• Kumar G, Garnova E, Reagin M, Vidali A (2008). „Vylepšená amplifikace vícenásobného vytěsnění pomocí phi29 DNA polymerázy pro genotypizaci jednotlivých lidských buněk“. Biotechniky. 44 (7): 879–90. doi:10.2144/000112755. PMID  18533898.
• Salas M, Blanco L, Lázaro JM, de Vega M (2008). "Bakteriofág phi29 DNA polymeráza". IUBMB Life. 60 (1): 82–5. doi:10.1002 / iub.19. PMID  18379997.
• Silander K, Saarela J (2008). Amplifikace celého genomu pomocí Phi29 DNA polymerázy pro umožnění genetické nebo genomické analýzy vzorků s nízkým výtěžkem DNA. Methods Mol Biol. Metody v molekulární biologii. 439. s. 1–18. doi:10.1007/978-1-59745-188-8_1. ISBN  978-1-58829-871-3. PMID  18370092.
• Lagunavicius A, Kiveryte Z, Zimbaite-Ruskuliene V, Radzvilavicius T, Janulaitis A (2008). "Dualita polynukleotidových substrátů pro DNA29 polymerázu Phi29: 3 '-> 5' aktivita RNázy enzymu". RNA. 14 (3): 503–13. doi:10,1261 / rna.622108. PMC  2248250. PMID  18230765.
• Pérez-Arnaiz P, Longás E, Villar L, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2007). „Zapojení fágové fí29 DNA polymerázy a terminálních proteinových subdomén do udělování specificity během zahájení replikace DNA aktivované proteinem“. Nucleic Acids Res. 35 (21): 7061–73. doi:10.1093 / nar / gkm 749. PMC  2175359. PMID  17913744.
• Berman AJ, Kamtekar S, Goodman JL, Lázaro JM, de Vega M, Blanco L, Salas M, Steitz TA (2007). „Struktury phi29 DNA polymerázy v komplexu se substrátem: mechanismus translokace v polymerázách rodiny B“. EMBO J.. 26 (14): 3494–505. doi:10.1038 / sj.emboj.7601780. PMC  1933411. PMID  17611604.
• Knierim D, Maiss E (2007). "Aplikace DNA29 polymerázy Phi29 při identifikaci a inokulaci klonu v plné délce viru thajského žlutého listu curl a viru tabáku leaf curl Thajsko". Arch Virol. 152 (5): 941–54. doi:10.1007 / s00705-006-0914-9. PMID  17226067.
• Owor BE, Shepherd DN, Taylor NJ, Edema R, Monjane AL, Thomson JA, Martin DP, Varsani A (2007). „Úspěšné použití technologie FTA Classic Card a použití bakteriofágové phi29 DNA polymerázy pro velkoplošné vzorkování a klonování genomů viru kompletní kukuřičné řady“. Metody J. Virol. 140 (1–2): 100–5. doi:10.1016 / j.jviromet.2006.11.004. PMID  17174409.
• Sato M, Ohtsuka M, Ohmi Y (2004). „Opakovaná analýza GenomiPhi, phi29 DNA polymerázy založená na amplifikaci valivého kruhu, je užitečná pro generování velkého množství plazmidové DNA“. Symp Serial Nucleic Acids (Oxf). 48 (48): 147–8. doi:10.1093 / nass / 48.1.147. PMID  17150521.
• Pérez-Arnaiz P, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2006). „Zapojení subdomény DNA polymerázy phi29 do správné koordinace syntézy a degradace během replikace DNA“. Nucleic Acids Res. 34 (10): 3107–15. doi:10.1093 / nar / gkl402. PMC  1475753. PMID  16757576.
• Kamtekar S, Berman AJ, Wang J, Lázaro JM, de Vega M, Blanco L, Salas M, Steitz TA (2006). „Struktura phi29 DNA polymerázy: protein-primer naznačuje model pro zahájení přechodu k prodloužení“. EMBO J.. 25 (6): 1335–43. doi:10.1038 / sj.emboj.7601027. PMC  1422159. PMID  16511564.
• Hutchison CA, Smith HO, Pfannkoch C, Venter JC (2005). „Bezbuněčné klonování pomocí phi29 DNA polymerázy“. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (48): 17332–6. doi:10.1073 / pnas.0508809102. PMC  1283157. PMID  16286637.
• Sato M, Ohtsuka M, Ohmi Y (2005). „Užitečnost opakovaného GenomiPhi, phi29 DNA polymerázové amplifikační soupravy pro válcování kruhů, pro generování velkého množství plazmidové DNA“. Biomol Eng. 22 (4): 129–32. doi:10.1016 / j.bioeng.2005.05.001. PMID  16023891.
• Rodríguez I, Lázaro JM, Blanco L, Kamtekar S, Berman AJ, Wang J, Steitz TA, Salas M, de Vega M (2005). „Specifická subdoména v DNA polymeráze phi29 propůjčuje jak procesivitu, tak kapacitu vytěsnění vlákna“. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (18): 6407–12. doi:10.1073 / pnas.0500597102. PMC  1088371. PMID  15845765.
• Truniger V, Bonnin A, Lázaro JM, de Vega M, Salas M (2005). "Zapojení" linkerové "oblasti mezi exonukleázou a polymeračními doménami phi29 DNA polymerázy ve vazbě DNA a TP". Gen. 348: 89–99. doi:10.1016 / j.gene.2004.12.041. PMID  15777661.
• Umetani N, de Maat MF, Mori T, Takeuchi H, Hoon DS (2005). "Syntéza univerzální nemetylované kontrolní DNA amplifikací vnořeného celého genomu pomocí phi29 DNA polymerázy". Biochem. Biophys. Res. Commun. 329 (1): 219–23. doi:10.1016 / j.bbrc.2005.01.088. PMID  15721296.
• Gadkar V, Rillig MC (2005). "Aplikace Phi29 DNA polymerázy zprostředkované amplifikace celého genomu na jednotlivé spory arbuskulárních mykorhizních (AM) hub". FEMS Microbiol Lett. 242 (1): 65–71. doi:10.1016 / j.femsle.2004.10.041. PMID  15621421.
• Kamtekar S, Berman AJ, Wang J, Lázaro JM, de Vega M, Blanco L, Salas M, Steitz TA (2004). „Pohledy na vytěsňování a procesivitu vláken z krystalové struktury proteinové DNA polymerázy bakteriofága phi29“. Mol Cell. 16 (4): 609–18. doi:10.1016 / j.molcel.2004.10.019. PMID  15546620.
• Adachi E, Shimamura K, Wakamatsu S, Kodama H (2004). "Amplifikace rostlinné genomové DNA pomocí Phi29 DNA polymerázy pro použití ve fyzickém mapování hypermethylované genomové oblasti". Rep. Rostlinných buněk. 23 (3): 144–7. doi:10.1007 / s00299-004-0806-r. PMID  15168072.
• Rodríguez I, Lázaro JM, Salas M, De Vega M (2004). „Interakce phi29 DNA polymeráza-terminální protein. Zapojení zbytků specificky konzervovaných mezi DNA polymerázami aktivovanými proteinem“. J Mol Biol. 337 (4): 829–41. doi:10.1016 / j.jmb.2004.02.018. PMID  15033354.
• Inoue-Nagata AK, Albuquerque LC, Rocha WB, Nagata T (2004). "Jednoduchá metoda klonování celého genomu begomoviru pomocí bakteriofága phi29 DNA polymerázy". Metody J. Virol. 116 (2): 209–11. doi:10.1016 / j.jviromet.2003.11.015. PMID  14738990.
• Truniger V, Lázaro JM, Salas M (2004). "Funkce C-konce phi29 DNA polymerázy ve vazbě na DNA a terminální protein". Nucleic Acids Res. 32 (1): 361–70. doi:10.1093 / nar / gkh184. PMC  373294. PMID  14729920.
• Truniger V, Lázaro JM, Salas M (2004). „Dva pozitivně nabité zbytky phi29 DNA polymerázy, konzervované v DNA polymerázách aktivovaných proteinem, se podílejí na stabilizaci příchozího nukleotidu.“ J Mol Biol. 335 (2): 481–94. doi:10.1016 / j.jmb.2003.10.024. PMID  14672657.
• Rodríguez I, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2003). „Phi29 DNA polymerázový zbytek Phe128 vysoce konzervativního (S / T) Lx (2) h motivu je vyžadován pro stabilní a funkční interakci s terminálním proteinem“. J Mol Biol. 325 (1): 85–97. doi:10.1016 / S0022-2836 (02) 01130-0. PMID  12473453.
• Nelson JR, Cai YC, Giesler TL, Farchaus JW, Sundaram ST, Ortiz-Rivera M, Hosta LP, Hewitt PL, Mamone JA, Palaniappan C, Fuller CW (2002). "TempliPhi, phi29 DNA polymeráza založená na amplifikaci templátových kruhů templátů pro sekvenování DNA". Biotechniky. Suppl: 44–7. PMID  12083397.
• Truniger V, Lázaro JM, Blanco L, Salas M (2002). „Vysoce konzervovaný lysinový zbytek v phi29 DNA polymeráze je důležitý pro správnou vazbu templatujícího nukleotidu během zahájení replikace DNA phi29“. J Mol Biol. 318 (1): 83–96. doi:10.1016 / S0022-2836 (02) 00022-0. PMID  12054770.
• Truniger V, Lázaro JM, Esteban FJ, Blanco L, Salas M (2002). „Pozitivně nabitý zbytek DNA polymerázy phi29, vysoce konzervovaný v DNA polymerázách z rodin A a B, se podílí na vazbě příchozího nukleotidu.“. Nucleic Acids Res. 30 (7): 1483–92. doi:10.1093 / nar / 30.7.1483. PMC  101840. PMID  11917008.
• Eisenbrandt R, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2002). „Phi29 DNA polymerázové zbytky Tyr59, His61 a Phe69 vysoce konzervovaného motivu ExoII jsou nezbytné pro interakci s terminálním proteinem“. Nucleic Acids Res. 30 (6): 1379–86. doi:10.1093 / nar / 30.6.1379. PMC  101362. PMID  11884636.
• Elías-Arnanz M, Salas M (1999). „Řešení čelních srážek mezi transkripčním aparátem a bakteriofágem phi29 DNA polymerázy závisí na translokaci RNA polymerázy“. EMBO J.. 18 (20): 5675–82. doi:10.1093 / emboj / 18.20.5675. PMC  1171634. PMID  10523310.
• de Vega M, Blanco L, Salas M (1999). „Procesivní korektury a prostorový vztah mezi aktivními místy polymerázy a exonukleázy DNA polymerázy bakteriofága phi29“. J Mol Biol. 292 (1): 39–51. doi:10.1006 / jmbi.1999.3052. PMID  10493855.
• Bonnin A, Lázaro JM, Blanco L, Salas M (1999). „Jediný tyrosin brání inzerci ribonukleotidů do DNA polymerázy eukaryotického typu phi29“. J Mol Biol. 290 (1): 241–51. doi:10.1006 / jmbi.1999.2900. PMID  10388570.
• Truniger V, Blanco L, Salas M (1999). „Role motivu„ YxGG / A “Phi29 DNA polymerázy v replikaci aktivované proteinem“. J Mol Biol. 286 (1): 57–69. doi:10.1006 / jmbi.1998.2477. PMID  9931249.
• de Vega M, Blanco L, Salas M (1998). „Phi29 DNA polymerázový zbytek Ser122, jednořetězcový DNA ligand pro 3'-5 'exonukleolýzu, je nutný pro interakci s terminálním proteinem“. J Biol Chem. 273 (44): 28966–77. doi:10.1074 / jbc.273.44.28966. PMID  9786901.
• Saturno J, Lázaro JM, Blanco L, Salas M (1998). „Role prvního aspartátového zbytku motivu„ YxDTDS “phi29 DNA polymerázy jako kovového ligandu během syntézy DNA aktivované TP i DNA“. J Mol Biol. 283 (3): 633–42. doi:10.1006 / jmbi.1998.2121. PMID  9784372.
• Murthy V, Meijer WJ, Blanco L, Salas M (1998). „Přepínání templátu DNA polymerázy na specifických místech genomu phi29 způsobuje akumulaci subgenomických molekul DNA phi29 in vivo“. Mol Microbiol. 29 (3): 787–98. doi:10.1046 / j.1365-2958.1998.00972.x. PMID  9723918.
• Illana B, Zaballos A, Blanco L, Salas M (1998). „Sekvence RGD v terminálním proteinu fágu phi29 je nutná pro interakci s phi29 DNA polymerázou“. Virologie. 248 (1): 12–9. doi:10.1006 / viro.1998.9276. PMID  9705251.
• de Vega M, Lázaro JM, Salas M, Blanco L (1998). "Mutační analýza phi29 zbytků DNA polymerázy působících jako ssDNA ligandy pro 3'-5 'exonukleolýzu". J Mol Biol. 279 (4): 807–22. doi:10.1006 / jmbi.1998.1805. PMID  9642062.
• Blanco L, Salas M (1996). "Vztah struktury k funkci v phi29 DNA polymeráze". J Biol Chem. 271 (15): 8509–12. doi:10.1074 / jbc.271.15.8509. PMID  8621470.
• de Vega M, Lazaro JM, Salas M, Blanco L (1996). "Stabilizace primeru a konce na aktivním místě 3'-5 'exonukleázy DNA polymerázy phi29. Zapojení dvou aminokyselinových zbytků vysoce konzervovaných v korektuře DNA polymeráz". EMBO J.. 15 (5): 1182–92. doi:10.1002 / j.1460-2075.1996.tb00457.x. PMC  450017. PMID  8605889.