Fragmentace (buněčná biologie) - Fragmentation (cell biology)

Pro další použití viz Fragmentace (disambiguation).

v buněčná biologie způsoby, jak fragmentace je vhodný pro buňku: klonování DNA a apoptóza. Klonování DNA je důležité v nepohlavní reprodukce nebo vytvoření identických molekul DNA a může být provedeno spontánně buňkou nebo záměrně laboratorními vědci. Apoptóza je programovaná destrukce buněk a molekul DNA v nich a je vysoce regulovaným procesem. Tyto dva způsoby, jak se fragmentace používá v buněčných procesech, popisují normální buněčné funkce a běžné laboratorní postupy prováděné s buňkami. Problémy v buňce však mohou někdy způsobit fragmentaci, která vede k nepravidelnostem, jako je fragmentace červených krvinek a fragmentace DNA spermií.

Klonování DNA

Klonování DNA může být buňkou provedeno spontánně pro reprodukční účely. Jedná se o formu nepohlavní reprodukce, kdy se organismus štěpí na fragmenty a poté se každý z těchto fragmentů vyvine do zralých, plně dospělých jedinců, kteří jsou klony původního organismu (viz reprodukční fragmentace ). Klonování DNA mohou provádět také úmyslně laboratorní vědci. Zde je fragmentace DNA molekulárně genetickou technikou, která umožňuje vědcům používat rekombinantní DNA technologie pro přípravu velkého počtu identických molekul DNA. Aby bylo možné klonování DNA dokončit, je nutné získat diskrétní malé oblasti DNA organismu, které tvoří specifické geny. Klonovat lze pouze relativně malé molekuly DNA do jakékoli dostupné látky vektor. Proto musí být dlouhé molekuly DNA, které tvoří genom organismu, štěpeny na fragmenty, které mohou být vloženy do vektorové DNA.[1] Produkci takových molekul rekombinantní DNA usnadňují dva enzymy:

1. Omezovací enzymy
Restrikční enzymy jsou endonukleázy produkovaný bakteriemi, které obvykle rozpoznávají sekvence malých párů bází (tzv restrikční weby ) a poté štěpte oba řetězce DNA na tomto místě.[2] Restrikčním místem je obvykle a palindromická sekvence, což znamená, že sekvence restrikčního místa je stejná na každém řetězci DNA při čtení ve směru 5 'až 3'.
U každého restrikčního enzymu bakterie také produkují modifikační enzym, takže vlastní DNA hostitelské bakterie je chráněna před štěpením. To se provádí modifikací hostitelské DNA na každém potenciálním místě štěpení nebo v jeho blízkosti. Modifikační enzym přidává a methylová skupina na jednu nebo dvě báze a přítomnost této methylové skupiny brání restrikční endonukleáze v rozřezání DNA.[3]
A
Řez, který vytváří lepivý konec
A
Řez, který vytváří tupý konec
Mnoho restrikčních enzymů provádí střídavé řezy ve dvou řetězcích DNA na svém rozpoznávacím místě, které generuje fragmenty s jedním řetězcem, který přesahuje na obou koncích a který se nazývá lepivý konec. Restrikční enzymy mohou také provádět přímé řezy ve dvou řetězcích DNA v jejich rozpoznávacím místě, což vytváří tupé konce.[4]
2. DNA ligáza
Během normální replikace DNA katalyzuje DNA ligáza end-to-end spojení (ligaci) krátkých fragmentů DNA, tzv. Okazaki fragmenty. Pro účely klonování DNA se purifikovaná DNA ligáza používá k kovalentnímu spojení konců restrikčního fragmentu a vektorové DNA, které mají komplementární konce. Jsou kovalentně ligovány dohromady přes standardní 3 'až 5' fosfodiesterové vazby DNA.[5]
DNA ligáza může ligovat komplementárně lepkavé a tupé konce, ale ligace tupých konců je neúčinná a vyžaduje vyšší koncentraci DNA i DNA ligázy než ligace lepivých konců.[6] Z tohoto důvodu většina restrikčních enzymů používaných při klonování DNA provádí střídavé řezy v řetězcích DNA a vytváří lepivé konce.

Klíčem ke klonování fragmentu DNA je jeho propojení s molekulou vektoru DNA, která se může replikovat v hostitelské buňce. Po zavedení jedné molekuly rekombinantní DNA (složené z vektoru plus vloženého fragmentu DNA) do hostitelské buňky může být vložená DNA replikována spolu s vektorem za vzniku velkého počtu identických molekul DNA.[7]Základní schéma lze shrnout takto:

Vektor + fragment DNA
↓
Rekombinantní DNA
↓
Replikace rekombinantní DNA v hostitelské buňce
↓
Izolace, sekvenování a manipulace s purifikovaným fragmentem DNA

Existuje mnoho experimentálních variací tohoto schématu, ale tyto kroky jsou nezbytné pro klonování DNA v laboratoři.[8]

Apoptóza

Fragmentace je třetím a posledním krokem demontáže buněk během apoptózy (pravá strana schématu).[9]

Apoptóza se týká zániku buněk specifickou formou programovaná buněčná smrt, vyznačující se dobře definovanou posloupností morfologických změn.[10] Buněčné a jaderné smršťování, kondenzace a fragmentace chromatinu, tvorba apoptotických tělísek a fagocytóza sousedními buňkami charakterizují hlavní morfologické změny v procesu apoptózy.[11] Rozsáhlé morfologické a biochemické změny během apoptózy zajišťují, že umírající buňky zanechávají minimální dopad na sousední buňky a / nebo tkáně.

Geny podílející se na řízení buněčné smrti kódují proteiny se třemi odlišnými funkcemi:[12]

  • Aby buňka zahájila apoptotický proces, jsou nutné „zabijácké“ proteiny
  • "Destrukční" proteiny dělají věci, jako je trávení DNA v umírající buňce
  • Proteiny „pohlcení“ jsou potřebné pro fagocytózu umírající buňky jinou buňkou

Štěpení chromozomální DNA na menší fragmenty je nedílnou součástí a biochemickým znakem apoptózy. Apoptóza zahrnuje aktivaci endonukleáz s následným štěpením chromatinové DNA na fragmenty 180 párů bází nebo násobky 180 párů bází (např. 360, 540). Tento vzor fragmentace lze použít k detekci apoptózy v testech, jako je a Žebříky DNA test s Gelová elektroforéza, a Test TUNEL nebo Stanovení Nicoletti.[13]Apoptotická fragmentace DNA závisí na enzymu zvaném DNáza aktivovaná kaspázou (CAD).[14] CAD je obvykle inhibován jiným proteinem v buňce, tzv Inhibitor kasasy aktivované DNázy (ICAD).[15] Aby mohla začít apoptóza, zavolal enzym kaspáza 3 štěpí ICAD, takže se aktivuje CAD. CAD poté štěpí DNA mezi nukleosomy, které se vyskytují v chromatinu v intervalech 180 párů bází. Místa mezi nukleosomy jsou jedinou částí DNA, která je vystavena a přístupná CAD.[16]

Nesrovnalosti

K fragmentaci DNA může dojít za určitých podmínek u několika různých typů buněk. To může vést k problémům pro buňku nebo to může vést k tomu, že buňka obdrží signál, aby podstoupila apoptózu. Níže uvádíme několik příkladů nepravidelné fragmentace, ke které může dojít v buňkách.

1. Fragmentace červených krvinek
A
Krevní nátěr od pacienta s hemolytickou anémií, ukazující schistocyty
Fragmentovaná červená krvinka je známá jako a schistocyt a je obecně výsledkem intracelulárního mechanického poškození červených krvinek.[17] Lze pozorovat širokou škálu schistocytů. Schistocyty jsou obvykle vidět v relativně nízkém počtu a jsou spojeny s podmínkami, ve kterých normálně hladká endoteliální výstelka, nebo endotel, je zdrsněný nebo nepravidelný a / nebo je cévní průchod zkřížen vlákny fibrin.[18] Schistocyty se běžně vyskytují u pacientů, kteří mají hemolytická anémie. Jsou také funkcí pro pokročilé anémie z nedostatku železa, ale v tomto případě je pozorovaná fragmentace s největší pravděpodobností výsledkem křehkosti buněk produkovaných za těchto podmínek.
2. Fragmentace DNA spermií
U průměrného muže budou méně než 4% jeho spermií obsahovat fragmentovanou DNA. Účast na chování, jako je kouření, však může významně zvýšit fragmentaci DNA ve spermatických buňkách. Existuje negativní korelace mezi procentem fragmentace DNA a pohyblivostí, morfologií a koncentrací spermií. Existuje také negativní asociace mezi procentem spermií, které obsahují fragmentovanou DNA, a rychlostí oplodnění a rychlostí štěpení embryí.[19]

Reference

  1. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon a Matthew P. Scott. Molekulární buněčná biologie. 7. vydání New York: W.H. Freeman a, 2013. Tisk.
  2. ^ Rao, Desirazu N., Swati Saha a Vinita Krishnamurthy. „Omezení enzymů závislých na ATP.“ Pokrok ve výzkumu nukleových kyselin a molekulární biologii 64 (2000): 1-63. Tisk.
  3. ^ Rao, Desirazu N., Swati Saha a Vinita Krishnamurthy. „Omezení enzymů závislých na ATP.“ Pokrok ve výzkumu nukleových kyselin a molekulární biologii 64 (2000): 1-63. Tisk.
  4. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon a Matthew P. Scott. Molekulární buněčná biologie. 7. vydání New York: W.H. Freeman a, 2013. Tisk.
  5. ^ Tomkinson, Alan E. a Zachary B. Mackey. „Struktura a funkce savčích DNA ligáz.“ Mutation Research / DNA Repair 407.1 (1998): 1-9. Tisk.
  6. ^ Hung, Mien-Chie a Pieter C. Wensink. „Různá restrikční lepkavá DNA generovaná enzymem může být spojena in vitro.“ Nucleic Acids Research 12.4 (1984): 1863-874. Tisk.
  7. ^ „Ch 20.“ Avonapbio /. N.p., n.d. Web. 20. listopadu 2012. <http://avonapbio.pbworks.com/w/page/9429274/Ch%2020 >.
  8. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon a Matthew P. Scott. Molekulární buněčná biologie. 7. vydání New York: W.H. Freeman a, 2013. Tisk.
  9. ^ Smith, Aaron; Parkes, Michael AF; Atkin-Smith, Georgia K; Tixeira, Rochelle; Poon, Ivan KH. "Demontáž buněk během apoptózy". WikiJournal of Medicine. 4 (1). doi:10.15347 / wjm / 2017.008.
  10. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon a Matthew P. Scott. Molekulární buněčná biologie. 7. vydání New York: W.H. Freeman a, 2013. Tisk.
  11. ^ Hua, Xhang J. a Ming Xu. „Fragmentace DNA u apoptózy.“ Cell Research 10 (2000): 205-11. Příroda. 17. července 2000. Web. 19. listopadu 2012.
  12. ^ Lodish, Harvey, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Kriger, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Angelika Amon a Matthew P. Scott. Molekulární buněčná biologie. 7. vydání New York: W.H. Freeman a, 2013. Tisk.
  13. ^ Bortner, Carl D., Nicklas B.E. Oldenburg a John A. Cidlowski. „Role fragmentace DNA v apoptóze.“ Trends in Cell Biology 5.1 (1995): 21-26. Tisk.
  14. ^ Jog, Neelakshi R., Lorenza Frisoni, Qin Shi, Marc Monestier, Sairy Hernandez, Joe Craft, Eline T. Luning Prak a Roberto Caricchio. „DNáza aktivovaná kaspázou je vyžadována pro udržení tolerance k jaderným autoantigenům Lupus.“ Artritida a revmatismus 64,4 (2012): 1247-256. Tisk.
  15. ^ Kutscher, Daniel, Alfred Pingoud, Albert Jeltsch a Gregor Meiss. "Identifikace peptidů odvozených od ICAD schopných inhibovat DNázu aktivovanou kaspázou." FEBS Journal 279.16 (2012): 2917-928. Tisk.
  16. ^ Bortner, Carl D., Nicklas B.E. Oldenburg a John A. Cidlowski. „Role fragmentace DNA v apoptóze.“ Trends in Cell Biology 5.1 (1995): 21-26. Tisk.
  17. ^ Bessman, JD. „Fragmentace červených krvinek. Vylepšená detekce a identifikace příčin.“ American Journal of Clinical Pathology 90,3 (1988): 268-73. Tisk.
  18. ^ „Schistocyty.“ Schistocyty. N.p., n.d. Web. 20. listopadu 2012. <http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/rbcmorph/schisto.htm >.
  19. ^ Sun, J. G., A. Jurisicova a R. F. Casper. „Detekce fragmentace deoxyribonukleové kyseliny v lidské spermatu: korelace s oplodněním in vitro.“ Biology of Reproduction 56.3 (1997): 602-07. Tisk.