Forenzní analýza DNA - Forensic DNA analysis - Wikipedia

Testování DNA na zděděná onemocnění viz Genetické testování.
Nesmí být zaměňována s Čárový kód DNA nebo Fenotypizace DNA.
Část série na
Forenzní věda
Horizontální dvojšroubovice DNA.png
Fyziologický

Profilování DNA je stanovení a DNA profil pro právní a vyšetřovací účely. Metody analýzy DNA se v průběhu let mnohokrát změnily, protože technologie se zdokonalila a umožnila stanovit více informací s menším množstvím výchozího materiálu. Moderní analýza DNA je založena na statistickém výpočtu vzácnosti vytvořeného profilu v populaci.

Zatímco je nejznámější jako nástroj při forenzních vyšetřováních, lze profilování DNA použít i pro jiné než forenzní účely. Testování otcovství a lidské genealogie výzkum jsou jen dvě z neforenzních použití profilování DNA.

Dějiny

Metody pro vytvoření profilu DNA byly vyvinuty Alec Jeffreys a jeho tým v roce 1984.[1]

Metody

Vysloužilé metody

Analýza RFLP

Šest jedinců s různým počtem opakování na jednom místě v jejich genomu zobrazených na gelu.
Viz také: Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

První skutečnou metodou profilování DNA byla analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů. První použití analýzy RFLP ve forenzních případech bylo ve Velké Británii v roce 1985.[2] Tento typ analýzy byl použit variabilní počet tandemových opakování (VNTR) rozlišovat mezi jednotlivci. VNTR jsou běžné v celém genomu a skládají se ze stejné DNA sekvence opakované znovu a znovu.[3] Různí jedinci mohou mít na určitém místě v genomu různý počet opakování.[2] Například osoba A může mít čtyři, zatímco osoba B může mít 5 opakování. Rozdíly byly vizualizovány pomocí procesu zvaného Gelová elektroforéza. Menší fragmenty by putovaly dále gelem než větší fragmenty, které by je oddělovaly.[4] Tyto rozdíly byly použity k rozlišení mezi jednotlivci a když bylo spuštěno více míst VNTR společně, RFLP analýza má vysoký stupeň individualizační síly.[5]

Proces analýzy RFLP byl extrémně časově náročný a vzhledem k délce použitých opakování mezi 9 a 100 páry bází,[3][6] metody zesílení, jako je polymerázová řetězová reakce nelze použít. Toto omezilo RFLP na vzorky, které již měly k dispozici větší množství DNA a neměly dobrý výkon u degradovaných vzorků.[7] Analýza RFLP byla primárním typem analýzy prováděné ve většině forenzních laboratoří, než byla nakonec vyřazena a nahrazena novějšími metodami. To bylo zcela opuštěno FBI v roce 2000 a nahrazena STR analýzou.[8]

Alfa testování DQ

Viz také: HLA-DQA1
DQ alfa testovací proužek vykazující pozitivní výsledek. Vyplněné tečky představují hodnoty alely pro daný vzorek.

Vyvinut v roce 1991,[8] Testování DQ alfa bylo první technikou forenzní DNA, která využívala polymerázovou řetězovou reakci.[9] Tato technika umožňovala použití mnohem méně buněk než analýza RFLP, což je užitečnější pro místa činu, které neměly velké množství materiálu DNA, které bylo dříve požadováno.[10] DQ alfa 1 místo (nebo umístění) bylo také polymorfní a měl několik různých alely které by mohly být použity k omezení skupiny jednotlivců, kteří by mohli vést k tomuto výsledku, a ke zvýšení pravděpodobnosti vyloučení.[11]

Lokalita DQ alfa byla kombinována s jinými lokusy v komerčně dostupné soupravě s názvem Polymarker v roce 1993.[12] Polymarker byl předchůdcem moderní doby multiplexování soupravy a umožnilo zkoumat více různých lokusů s jedním produktem. Polymarker byl sice citlivější než analýza RFLP, ale neobsahoval stejnou diskriminační sílu jako starší testování RFLP.[12] V roce 1995 se vědci pokusili vrátit k analýze založené na VNTR v kombinaci s technologií PCR zvanou polymorfismy délky amplifikovaných fragmentů (AmpFLP).[8]

AmpFLP

An agarózový gel ukazující lokus D1S80 běžel ve více pruzích pomocí AmpFLP.
Viz také: Zesílený polymorfismus délky fragmentu

AmpFLP byl prvním pokusem spojit analýzu VNTR s PCR pro forenzní případy. Tato metoda používala kratší VNTR než analýza RFLP, mezi 8 a 16 páry bází. Menší velikosti párů bází AmpFLP byly navrženy tak, aby lépe fungovaly s procesem amplifikace PCR.[6] Doufalo se, že tato technika umožní rozlišovací schopnost analýzy RFLP se schopností zpracovávat vzorky, které mají méně templátové DNA pro práci nebo které byly jinak degradovány. Pouze několik lokusů však bylo validováno pro forenzní aplikace pro práci s analýzou AmpFLP, protože forenzní laboratoře rychle přešly na jiné techniky, což omezilo její diskriminační schopnost forenzních vzorků.[13]

Tato technika nakonec nebyla nikdy široce používána, i když se stále používá v menších zemích kvůli nižším nákladům a jednoduššímu nastavení ve srovnání s novějšími metodami.[14][15] Na konci 90. let začaly laboratoře přecházet na novější metody včetně STR analýzy. Ty používaly ještě kratší fragmenty DNA a mohly být spolehlivěji amplifikovány pomocí PCR při zachování a zlepšování diskriminační síly starších metod.[8]

Současné metody

STR analýza

Hlavní článek: STR analýza
Částečné elektroferogram vytvořeno analýzou STR.

Analýza krátkého tandemového opakování (STR) je primárním typem forenzní analýzy DNA prováděné v moderních laboratořích DNA. STR analýza vychází z RFLP a AmpFLP používaných v minulosti zmenšením velikosti opakovacích jednotek na 2 až 6 párů bází a spojením více různých lokusů do jedné PCR reakce. Tyto soupravy pro multiplexování mohou produkovat hodnoty alel pro desítky různých lokusů v celém genomu a současně omezit dobu potřebnou k získání úplného, ​​individualizujícího profilu. Analýza STR se stala zlatým standardem pro profilování DNA a je hojně používána ve forenzních aplikacích.

Analýzu STR lze také omezit pouze na Y chromozom. Y-STR analýzu lze použít v případech, které zahrnují otcovství nebo v rodinné vyhledávání protože chromozom Y je shodný po otcovské linii (kromě případů, kdy a mutace došlo). Některé sady pro multiplexování kombinují autosomální i Y-STR lokusy do jedné sady, což dále zkracuje dobu potřebnou k získání velkého množství dat.

sekvenování mtDNA

Viz také: Mitochondriální DNA

Sekvenování mitochondriální DNA je specializovaná technika, která využívá samostatnou mitochondriální DNA přítomnou ve většině buněk. Tato DNA se předává po hmotné linii a mezi jednotlivci není jedinečná. Avšak vzhledem k počtu mitochondrií přítomných v buňkách lze mtDNA analýzu použít pro vysoce degradované vzorky nebo vzorky, kde STR analýza neprodukuje dostatek dat, aby byla užitečná. mtDNA je také přítomna v místech, kde by chyběla autozomální DNA, například ve vlasových šachtách.

Z důvodu zvýšené šance na kontaminaci při práci s mtDNA zpracovává mitochondriální vzorky jen málo laboratoří. Ti, kteří mají zavedené specializované protokoly, které od sebe navzájem oddělují různé vzorky, aby nedocházelo ke křížové kontaminaci.

Rychlá DNA

Hlavní článek: Rychlá DNA

Rapid DNA je technologie „swab in-profile out“, která zcela automatizuje celý proces extrakce, amplifikace a analýzy DNA. Nástroje rychlé DNA jsou schopny přejít z výtěru na profil DNA za pouhých 90 minut a eliminuje potřebu vyškolených vědců provádět tento proces. Tyto nástroje jsou zkoumány pro použití v procesu rezervace pachatele, což umožňuje policistům získat profil DNA zatčené osoby.

Nedávno Zákon o rychlé DNA z roku 2017 byl přijat ve Spojených státech a nařídil FBI, aby vytvořilo protokoly pro implementaci této technologie v celé zemi. V současné době není DNA získaná z těchto nástrojů způsobilá k nahrání do národních databází DNA, protože neanalyzuje dostatek lokusů, aby splnila standardní prahovou hodnotu. Několik policejních agentur však již používá nástroje rychlé DNA ke sběru vzorků od osob zatčených v jejich oblasti. Tyto místní databáze DNA nepodléhají federálním ani státním předpisům.

Masivně paralelní řazení

Hlavní článek: Masivní paralelní řazení

Také známé jako sekvenování příští generace, masivně paralelní sekvenování (MPS) staví na STR analýze zavedením přímého sekvenování lokusů. Místo počtu opakování přítomných na každém místě by MPS poskytl vědci skutečnou sekvenci párů bází. Teoreticky má MPS schopnost rozlišovat mezi identickými dvojčaty, protože náhodné bodové mutace by byly vidět v opakovaných segmentech, které by nebyly zachyceny tradiční STR analýzou.

Profilová rarita

Pokud je profil DNA použit evidentně, je k dispozici statistika shody, která vysvětluje, jak vzácný je profil v populaci. Konkrétně tato statistika představuje pravděpodobnost, že osoba náhodně vybraná z populace bude mít tento specifický profil DNA. Není pravděpodobné, že profil „odpovídá“ někomu. Existuje několik různých metod pro stanovení této statistiky a každou z nich používají různé laboratoře na základě svých zkušeností a preferencí. Výpočty poměru pravděpodobnosti se však stávají upřednostňovanou metodou před ostatními dvěma nejčastěji používanými metodami, náhodným člověkem, který není vyloučen, a kombinovanou pravděpodobností zařazení. Statistiky shody jsou obzvláště důležité při interpretaci směsi, kde je více než jeden přispěvatel do profilu DNA. Jsou-li tyto statistiky uvedeny v soudní síni nebo v laboratorní zprávě, jsou obvykle uvedeny pro tři nejběžnější rasy dané konkrétní oblasti. Je to proto, že frekvence alel na různých lokusech se měnily na základě předků jednotlivce. https://strbase.nist.gov/training/6_Mixture-Statistics.pdf

Náhodný člověk není vyloučen

Hlavní článek: Náhodný člověk není vyloučen

Pravděpodobnost produkovaná touto metodou je pravděpodobnost, že osobu náhodně vybranou z populace nelze z analyzovaných dat vyloučit. Tento typ statistiky shody je snadné vysvětlit v soudní síni jednotlivcům, kteří nemají vědecké pozadí, ale také ztrácí hodně diskriminační síly, protože nezohledňuje genotyp podezřelého. Tento přístup se běžně používá, když je vzorek degradován nebo obsahuje tolik přispěvatelů, že nelze určit singulární profil. Je také užitečné vysvětlit laikům, protože způsob získání statistiky je přímočarý. Kvůli omezené diskriminační síle se však RMNE obecně neprovádí, pokud nelze použít jinou metodu. RMNE se nedoporučuje používat v datech, která indikují přítomnost směsi.

Kombinovaná pravděpodobnost zařazení / vyloučení

Jeden zdrojový profil zobrazující dvě alely v lokusu vWA.
Směs pro tři osoby ukazující čtyři alely v lokusu vWA.

Kombinovaná pravděpodobnost zařazení nebo vyloučení vypočítá pravděpodobnost, že náhodná, nesouvisející osoba bude přispívat k profilu DNA nebo směsi DNA. V této metodě se statistika pro každý jednotlivý lokus určuje pomocí statistik populace a poté se kombinuje, aby se získal celkový CPI nebo CPE. Tyto výpočty se opakují pro všechna dostupná místa se všemi dostupnými údaji a poté se každá hodnota vynásobí, aby se získala celková kombinovaná pravděpodobnost zařazení nebo vyloučení. Protože se hodnoty násobí společně, lze pomocí CPI dosáhnout extrémně malého počtu. CPI nebo CPE se považuje za přijatelný statistický výpočet, když je uvedena směs. https://www.promega.com/-/media/files/resources/conference-proceedings/ishi-15/parentage-and-mixture-statistics-workshop/generalpopulationstats.pdf?la=cs

Příklad výpočtu pro profil jednoho zdroje

Pravděpodobnost, že běloch bude mít alelu 16 v vWA = .10204

Pravděpodobnost, že běloch bude mít v alele 17 alel vWA = .26276

Pravděpodobnost, že běloch bude mít alelu 14 i 17 (P) = 0,10204 + 0,26276 = 0,3648

Pravděpodobnost přítomnosti všech ostatních alel (Q) = 1 - P nebo 1 - .3648 = .6352

Pravděpodobnost vyloučení pro vWA = Q2 + 2Q (1-Q) nebo .63522 + 2(.6352)(1 - .6352) = .86692096 ≈ 86.69%

Pravděpodobnost zařazení pro vWA = 1 - CPE nebo 1 - .86692096 = .13307904 ≈ 13.31%

Příklad výpočtu profilu směsi

Pravděpodobnost, že běloch bude mít alelu 14 v vWA = .10204

Pravděpodobnost, že běloch bude mít alelu 15 v vWA = .11224

Pravděpodobnost, že běloch bude mít alelu 16 v vWA = .20153

Pravděpodobnost, že běloch bude mít alelu 19 v vWA = .08418

Pravděpodobnost, že běloch bude mít alelu 14, 15, 16 nebo 19 (P) = 0,10204 + .11224 + .20153 + .08418 = .49999

Pravděpodobnost přítomnosti všech ostatních alel (Q) = 1 - P nebo 1 - .49999 = .50001

Pravděpodobnost vyloučení pro vWA = Q2 + 2Q (1-Q) nebo .500012 + 2(.50001)(1 - .50001) = .7500099999 ≈ 75%

Pravděpodobnost začlenění pro vWA = 1 - CPE nebo 1 - .7500099999 = .2499900001 ≈ 25%

Míra pravděpodobnosti

Likelihood ratios (LR) are a comparison of two different probencies to determine which one is more likely. Pokud jde o soudní řízení, je LR pravděpodobnost argumentu obžaloby versus pravděpodobnost argumentu obhajoby vzhledem k jejich výchozím předpokladům. V tomto scénáři je pravděpodobnost stíhání často rovna 1, protože se předpokládá, že stíhání nebude stíhat podezřelého, pokud si není zcela jisté (100%), že má správnou osobu. Poměry pravděpodobnosti se v laboratořích stávají běžnějšími kvůli jejich užitečnosti při předkládání statistik pro údaje, které indikují více přispěvatelů, jakož i jejich použití v pravděpodobnostní genotypový software který předpovídá nejpravděpodobnější kombinace alel dané sadě dat.

Nevýhody použití poměrů pravděpodobnosti spočívají v tom, že je velmi obtížné pochopit, jak analytici dospěli ke konkrétní hodnotě a jak se do rovnic zavádí více údajů, komplikuje se zapojená matematika. Za účelem boje proti těmto problémům v soudní síni zavedly některé laboratoře „slovní měřítko“, které nahrazuje skutečnou číselnou hodnotu poměru pravděpodobnosti.

Reference

  1. ^ McKie, Robin (23. května 2009). „Moment heuréky, který vedl k objevení DNA otisků prstů“. Opatrovník. Citováno 29. října 2017.
  2. ^ A b „Typing DNA by RFLP Analysis“. Národní forenzní vědecké technologické centrum. 2005. Archivováno od originálu 3. ledna 2015. Citováno 10. listopadu 2017.
  3. ^ A b Griffiths, Anthony J.F .; Lewontin, Richard C .; Gelbart, William M .; Miller, Jeffrey H. Moderní genetická analýza: Integrace genů a genů (Druhé vydání.). W. H. Freeman and Company. p. 274. Citováno 10. listopadu 2017.
  4. ^ Fisher, Barry A. J. (2005). Techniky vyšetřování kriminální scény (Sedmé vydání). CRC Press. p. 240. Citováno 11. listopadu 2017.
  5. ^ Rudin, Norah; Inman, Keith (2002). Úvod do forenzní analýzy DNA (Druhé vydání.). CRC Press. p.41. Citováno 11. listopadu 2017.
  6. ^ A b James, Stuart H .; Nordby, Jon J., eds. (2005). Forenzní věda: Úvod do vědeckých a vyšetřovacích technik (Druhé vydání.). Taylor & Francis. p. 286. Citováno 10. listopadu 2017.
  7. ^ „Nevýhody“. Národní forenzní vědecké technologické centrum. 2005. Archivováno od originálu 2. ledna 2015. Citováno 10. listopadu 2017.
  8. ^ A b C d Tilstone, William J .; Savage, Kathleen A .; Clark, Leigh A. (2006). Forensic Science: Encyclopedia of History, Methods and Techniques. ABC CLIO. p. 49. Citováno 30. října 2017.
  9. ^ Riley, Donald E. (6. dubna 2005). „Testování DNA: Úvod pro nevědecké pracovníky Ilustrované vysvětlení“. Citováno 29. října 2017.
  10. ^ McClintock, J. Thomas (2008). Forenzní analýza DNA: Laboratorní příručka. CRC Press. p. 64. Citováno 29. října 2017.
  11. ^ Blake, E; Mihalovich, J; Hiquchi, R; Walsh, PS; Erlich, H (květen 1992). „Amplifikace polymerázové řetězové reakce (PCR) a typizace lidského leukocytového antigenu (HLA) -DQ alfa oligonukleotidu na vzorcích biologických důkazů: zkušenost s případy“. Journal of Forensic Sciences. 37 (3): 700–726. PMID  1629670.
  12. ^ A b „DQ-Alpha“. Národní forenzní vědecké technologické centrum. 2005. Archivováno od originálu 10. listopadu 2014. Citováno 30. října 2017.
  13. ^ Bär, W .; Fiori, A .; Rossi, U., vyd. (Říjen 1993). Pokroky ve forenzní hemogenetice. 15. kongres Mezinárodní společnosti pro forenzní hemogenetiku. p. 255. Citováno 10. listopadu 2017.
  14. ^ „AmpFLPs“. Národní forenzní vědecké technologické centrum. 2005. Archivováno od originálu 21. listopadu 2014. Citováno 5. listopadu 2017.
  15. ^ „DNA Fingerprinting Methods“. Fingerprinting.com. Citováno 5. listopadu 2017.