Amplifikace rekombinázové polymerázy - Recombinase polymerase amplification

Amplifikace rekombinázové polymerázy (RPA) je jediná trubice, izotermická alternativa k polymerázová řetězová reakce (PCR).^[1] Přidáním a reverzní transkriptáza enzym na RPA reakci, kterou dokáže detekovat RNA stejně jako DNA, aniž by bylo nutné vyrábět samostatný krok cDNA,.^[2][3][4] Protože to je izotermický „RPA může používat mnohem jednodušší zařízení než PCR, což vyžaduje a termální cyklovač. Nejlepší provoz při teplotách 37–42 ° C a stále funkční, i když pomaleji, při pokojové teplotě znamená, že reakce RPA lze teoreticky rychle spustit jednoduše přidržením zkumavky. Díky tomu je RPA vynikajícím kandidátem na vývoj levných, rychlých a molekulárních testů v místě péče. Mezinárodní hodnocení kvality molekulární detekce Virus horečky Rift Valley provedeny stejně jako nejlepší RT-PCR testy, detekce méně koncentrovaných vzorků zmeškaných některými PCR testy a an RT-LAMP test.^[5]RPA vyvinula a uvedla na trh společnost TwistDx Ltd. (dříve známá jako ASM Scientific Ltd), biotechnologická společnost se sídlem v Cambridge ve Velké Británii.

Technika

Proces RPA využívá tři jádra enzymy - a rekombináza, a jednovláknový protein vázající DNA (SSB) a přemisťování vláken polymeráza. Rekombinázy jsou schopné párování oligonukleotid primery s homologní sekvencí v duplexní DNA.^[1] SSB se váží na přemístěné řetězce DNA a brání primery před vysídlením. Nakonec začíná polymeráza vytěsňující řetězec Syntéza DNA kde se primer navázal na cílovou DNA. Použitím dvou protilehlých primerů, podobně jako PCR, je-li cílová sekvence skutečně přítomna, exponenciální Amplifikace DNA je zahájena reakce. K zahájení amplifikace není nutná žádná další manipulace se vzorkem, jako je tepelné nebo chemické tavení. Při optimálních teplotách (37–42 ° C) reakce rychle postupuje a vede ke specifické amplifikaci DNA od několika cílových kopií k detekovatelným úrovním, obvykle do 10 minut, pro rychlou detekci virové genomové DNA nebo RNA,^{[2][3][4][6][7][8]} patogenní bakteriální genomová DNA,^[9][10] stejně jako DNA aptameru krátké délky.^[11]

Tři základní RPA enzymy mohou být doplněny dalšími enzymy, aby poskytly další funkčnost. Přidání exonukleáza III umožňuje použití sondy exo pro detekci fluorescence v reálném čase podobnou PCR v reálném čase.^[1] Přidání endonukleáza IV znamená, že lze použít sondu nfo detekce proudění v bočním toku úspěšného zesílení.^[1][6][12] Pokud je přidána reverzní transkriptáza, která pracuje při 37–42 ° C, pak může být RNA reverzně transkribována a produkovaná cDNA amplifikována vše v jednom kroku. V současné době je k dispozici pouze verze RPA TwistAmp exo se zahrnutou reverzní transkriptázou, i když uživatelé mohou jednoduše doplnit další reakce TwistAmp reverzní transkriptázou, aby se dosáhlo stejného účinku. Stejně jako u PCR lze všechny formy RPA reakcí multiplexovaný přidáním dalších párů primer / sonda, což umožňuje detekci více analytů nebo vnitřní kontrolu ve stejné zkumavce.

Vztah k dalším zesilovacím technikám

RPA je jednou z několika technik amplifikace izotermických nukleových kyselin, které mají být vyvinuty jako technika molekulární diagnostiky, často s cílem zjednodušit požadované laboratorní vybavení ve srovnání s PCR. Částečný seznam dalších izotermických amplifikačních technik zahrnuje SVÍTILNA, NASBA, zesílení závislé na helikáze (HDA) a reakce zesílení enzymu škrábání (U). Techniky se liší ve specifikách designu primeru a mechanismu reakce a v některých případech (například RPA) využívají koktejly dvou nebo více enzymů. Stejně jako RPA, mnoho z těchto technik nabízí rychlé doby amplifikace s potenciálem pro zjednodušené vybavení a hlášenou rezistenci vůči látkám v neočištěných vzorcích, o nichž je známo, že inhibují PCR. Pokud jde o dobu amplifikace, moderní termocyklery s rychlými teplotními rampami mohou zkrátit dobu amplifikace PCR na méně než 30 minut, zejména u krátkých amplikonů využívajících spíše duální teplotní cyklování než běžné tři teplotní protokoly.^[13] Kromě toho by požadavky na přípravu vzorku (včetně lýzy a extrakce DNA nebo RNA, pokud je to nutné) měly být považovány za součást celkového času a složitosti vlastní technice. Tyto požadavky se liší podle techniky, konkrétního cíle a typu vzorku.

Ve srovnání s PCR jsou pokyny pro návrh primeru a sondy pro RPA méně zavedené a mohou vyžadovat určitý stupeň pokusů a omylů, i když nedávné výsledky naznačují, že mohou fungovat i standardní PCR primery.^[14] Obecný princip diskrétního amplikonu ohraničeného přímým a reverzním primerem s (volitelnou) vnitřní fluorogenní sondou je podobný PCR. PCR primery mohou být použity přímo v RPA, ale jejich krátká délka znamená, že rychlosti rekombinace jsou nízké a RPA nebude nijak zvlášť citlivý ani rychlý. Pro efektivní tvorbu rekombinázových vláken a výkonnost RPA je obvykle zapotřebí 30–38 základních primerů. To je v kontrastu s některými dalšími technikami, jako je LAMP, které používají větší počet primerů s výhradou dalších konstrukčních omezení. Ačkoli původní zpráva RPA z roku 2006 popisuje funkční sadu reakčních složek, současná (patentovaná) formulace soupravy TwistAmp je „podstatně odlišná“ ^[15] a je k dispozici pouze od dodavatele TwistDx. To je ve srovnání s reakčními směsmi pro PCR které jsou k dispozici od mnoha dodavatelů, nebo SVÍTILNA nebo NASBA pro které je složení reakční směsi volně publikováno, což umožňuje vědcům vytvářet si vlastní „soupravy“ na míru z levných ingrediencí.

Publikovaná vědecká literatura obecně postrádá podrobné srovnání výkonu izotermických amplifikačních technik, jako jsou RPA, HDA a LAMP, ve srovnání s ostatními, často spíše srovnávající jedinou izotermickou techniku ​​s "zlatým standardem" PCR. To ztěžuje posouzení podstaty těchto technik nezávisle na tvrzeních výrobců, vynálezců nebo navrhovatelů. Kromě toho je obtížné oddělit výkonové charakteristiky jakékoli techniky amplifikace od designu primerů: „dobrá“ sada primerů pro jeden cíl pro RPA může poskytnout rychlejší amplifikaci nebo citlivější detekci než „špatná“ sada LAMP primerů pro stejný cíl, ale konverzace může platit pro různé sady primerů pro jiný cíl. Výjimkou je nedávná studie porovnávající RT-qPCR, RT-LAMP a RPA pro detekci viru Schmallenberg a viru bovinního virového průjmu,^[16] což účinně znamená, že každá zesilovací technika má silné a slabé stránky, které se mohou u jednotlivých cílů lišit, a že je třeba vyhodnotit vlastnosti dostupných zesilovacích technik v kombinaci s požadavky pro každou aplikaci. Stejně jako u PCR a jakékoli jiné amplifikační techniky existuje zjevně zkreslení publikace, přičemž špatně fungující sady primerů jsou zřídka považovány za hodné hlášení.

Reference