Smyčkově zprostředkovaná izotermická amplifikace - Loop-mediated isothermal amplification - Wikipedia

Smyčkově zprostředkovaná izotermická amplifikace (SVÍTILNA) je technika s jednou trubicí pro zesílení DNA[1][2] a nízkonákladová alternativa k detekci určitých nemocí. Izotermická amplifikace zprostředkovaná reverzní transkripcí smyčkou (RT-LAMP) kombinuje LAMP s a reverzní transkripce krok umožňující detekci RNA.

LAMP je izotermická technika amplifikace nukleových kyselin. Na rozdíl od polymerázová řetězová reakce (PCR) technologie, při které se reakce provádí s řadou střídavých teplotních kroků nebo cyklů, izotermická amplifikace se provádí při konstantní teplotě a nevyžaduje termální cyklovač.

Technika

V LAMP je cílová sekvence amplifikována při konstantní teplotě 60–65 ° C pomocí dvou nebo tří sad primery a a polymeráza s aktivitou vytěsnění vysokého řetězce kromě aktivity replikace. Typicky se k amplifikaci 6 odlišných oblastí na cílovém genu používají 4 různé primery, což zvyšuje specificitu. Další dvojice „smyčkových primerů“ může dále urychlit reakci.[3] Množství DNA produkované v LAMP je podstatně vyšší než PCR - zesílení na základě.

Schéma LAMP biomarkerů nukleových kyselin ze vzorků surové neošetřené odpadní vody pro rychlou kvantifikaci lidské specifické mitochondriální DNA (mtDNA).[4]

Produkt amplifikace lze detekovat fotometrií měřením zákalu způsobeného hořčíkem pyrofosfát sraženina v roztoku jako vedlejší produkt amplifikace.[5] To umožňuje snadnou vizualizaci pouhým okem nebo pomocí jednoduchých fotometrických detekčních postupů pro malé objemy. Reakci lze sledovat v reálném čase buď měřením zákalu[6] nebo fluorescencí pomocí interkalačních barviv, jako je SYTO 9.[7] Barviva, jako např SYBR zelená, lze použít k vytvoření viditelné změny barvy, kterou lze vidět pouhým okem bez nutnosti nákladného vybavení, nebo pro odezvu, kterou lze přesněji měřit pomocí přístrojů. Molekuly barviva interkalují nebo přímo označují DNA a mohou být korelovány s počátečním počtem kopií. Proto může být LAMP také kvantitativní.

In-tube detekce LAMP DNA amplifikace je možná s použitím manganu kalcein který začíná fluoreskovat po komplexaci manganu s pyrofosfátem během syntézy DNA in vitro.[8]

Další metoda vizuální detekce LAMP amplikonů pouhým okem byla založena na jejich schopnosti hybridizovat s komplementární ss-DNA vázanou na zlato a zabránit tak normální změně červené až fialově modré barvy, ke které by jinak došlo během agregace solí vyvolané zlaté částice. Metoda LAMP v kombinaci s detekcí amplikonu pomocí AuNP může mít oproti jiným metodám výhody, pokud jde o zkrácení doby testu, potvrzení amplikonu hybridizací a použití jednoduššího vybavení (tj. Není potřeba termocykler, elektroforetické zařízení nebo UV trans-iluminátor .[9][10]

Použití a výhody

LAMP je relativně nová technika amplifikace DNA, která by díky své jednoduchosti, robustnosti a nízké ceně mohla poskytnout velké výhody. LAMP má potenciál být používán jako jednoduchý screeningový test v terénu nebo v místě péče klinickými lékaři.[11] Protože LAMP je izotermický, což eliminuje potřebu drahých termocyklerů používaných v konvenční PCR, může to být obzvláště užitečný způsob diagnostiky infekčních onemocnění v zemích s nízkými a středními příjmy.[12] LAMP je široce studován pro detekci infekčních onemocnění, jako je tuberkulóza,[13] malárie,[14][15][16] spavá nemoc,[17] a SARS-CoV-2.[18][19] V rozvojových regionech je ještě třeba rozsáhle validovat další běžné patogeny.[11]

Bylo pozorováno, že LAMP je méně citlivý (odolnější) než PCR na inhibitory ve složitých vzorcích, jako je krev, pravděpodobně kvůli použití jiné DNA polymerázy (obvykle Bst – Bacillus stearothermophilus - spíše DNA polymeráza než Taq polymeráza jako v PCR). Několik zpráv popisuje úspěšnou detekci patogenů z minimálně zpracovaných vzorků, jako je tepelně ošetřená krev,[20][21] nebo v přítomnosti matic klinických vzorků.[22] Tato vlastnost LAMP může být užitečná v prostředí s nízkými zdroji nebo v terénu, kde může být konvenční extrakce DNA nebo RNA před diagnostickým testováním nepraktická.

Omezení

LAMP je méně univerzální než PCR, nejznámější technika amplifikace nukleových kyselin. LAMP je užitečný především jako diagnostická nebo detekční technika, ale není vhodný pro klonování nebo mnoho dalších aplikací molekulární biologie umožněných pomocí PCR. Protože LAMP používá 4 (nebo 6) primery zaměřené na 6 (nebo 8) oblastí v poměrně malém segmentu genomu a protože design primerů podléhá mnoha omezením, je obtížné navrhnout sady primerů pro LAMP „okem“. Zdarma, open-source[23] nebo komerční softwarové balíčky jsou obecně používány na pomoc s designem LAMP primeru, ačkoli omezení designu primeru znamenají, že je menší svoboda volby cílového místa než u PCR.

V diagnostické aplikaci to musí být vyváženo proti potřebě vybrat vhodný cíl (např. Konzervované místo ve vysoce variabilním virovém genomu nebo cíl, který je specifický pro konkrétní kmen patogenu). Pro pokrytí různých variantních kmenů stejného druhu může být zapotřebí více degenerovaných sekvencí. Důsledkem takového koktejlu primerů může být nespecifická amplifikace v pozdní amplifikaci.

Přístupy multiplexování pro LAMP jsou méně rozvinuté než pro PCR. Větší počet primerů na cíl v LAMP zvyšuje pravděpodobnost interakcí primer-primer pro multiplexované sady cílů. Produktem LAMP je řada concatemers cílové oblasti, což vede k charakteristickému "žebříku" nebo pruhovému vzoru na gelu, spíše než k jednomu pásku jako u PCR. I když to není problém při detekci jednotlivých cílů pomocí LAMP, „tradiční“ (koncový bod) multiplexní PCR aplikace, kde identita cíle je potvrzena velikostí pásu na gelu, nejsou s LAMP proveditelné. Multiplexování v LAMP bylo dosaženo výběrem cílové oblasti s restrikčním místem a digescí před nanesením na gel, takže každý produkt vede k odlišné velikosti fragmentu,[24] i když tento přístup dodává experimentálnímu designu a protokolu složitost.

Použití DNA polymerázy vytěsňující vlákno v LAMP také vylučuje použití hydrolýzních sond, např. TaqMan sondy, které se spoléhají na 5'-3 ' exonukleáza činnost Taq polymeráza. Byl popsán alternativní přístup multiplexování v reálném čase založený na fluorescenčních zhášečích.[25]

K zobrazení LAMP v reálném čase lze přidat zelené barvivo SYBR. Avšak při pozdní amplifikaci může amplifikace primer-dimer přispívat k falešně pozitivnímu signálu. Na rozdíl od tradičních testů PCR na bázi SYBR-green nelze v LAMP provést analýzu křivky tání pro kontrolu přítomnosti dimery primeru.[Citace je zapotřebí ]

Viz také

Reference

  1. ^ Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000). „Smyčkově zprostředkovaná izotermická amplifikace DNA“. Nucleic Acids Res. 28 (12): 63e – 63. doi:10.1093 / nar / 28.12.e63. PMC  102748. PMID  10871386.
  2. ^ US patent 6410278, Notomi T, Hase T, „Proces syntézy nukleové kyseliny“, publikováno 25. 6. 2002, přidělen Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha 
  3. ^ Nagamine K, Hase T, Notomi T (2002). "Zrychlená reakce smyčkově zprostředkovanou izotermickou amplifikací pomocí smyčkových primerů". Mol. Buňka. Sondy. 16 (3): 223–9. doi:10.1006 / mcpr.2002.0415. PMID  12144774.
  4. ^ Yang, Zhugen; Xu, Gaolian; Reboud, Julien; Kasprzyk-Hordern, Barbara; Cooper, Jonathan M. (19. září 2017). „Monitorování genetických populačních biomarkerů pro epidemiologii založenou na odpadních vodách“. Analytická chemie. 89 (18): 9941–9945. doi:10.1021 / acs.analchem.7b02257. PMID  28814081.
  5. ^ Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T (2001). „Detekce smyčkami zprostředkované izotermické amplifikační reakce zákalu odvozenou z tvorby pyrofosforečnanu hořečnatého“. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1): 150–4. doi:10.1006 / bbrc.2001.5921. PMID  11708792.
  6. ^ Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T (2004). "Turbidimetrie reakce LAMP v reálném čase pro kvantifikaci templátové DNA". J. Biochem. Biophys. Metody. 59 (2): 145–57. doi:10.1016 / j.jbbm.2003.12.005. PMID  15163526.
  7. ^ Njiru ZK, Mikosza AS, Armstrong T, Enyaru JC, Ndung'u JM, Thompson AR (2008). „Metoda izotermické amplifikace (LAMP) zprostředkovaná smyčkou pro rychlou detekci Trypanosoma brucei rhodesiense“. PLOS Negl Trop Dis. 2 (1): e147. doi:10.1371 / journal.pntd.0000147. PMC  2238707. PMID  18253475.
  8. ^ Tomita N, Mori Y, Kanda H, Notomi T (2008). „Smyčkově zprostředkovaná izotermická amplifikace (LAMP) genových sekvencí a jednoduchá vizuální detekce produktů“. Nat Protoc. 3 (5): 877–82. doi:10.1038 / nprot.2008.57. PMID  18451795. S2CID  19416838.
  9. ^ Arunrut, Narong; Kampeera, Jantana; Sirithammajak, Sarawut; Sanguanrut, Piyachat; Proespraiwong, Porranee; Suebsing, Rungkarn; Kiatpathomchai, Wansika (2016). „Citlivá vizuální detekce bakterií AHPND pomocí smyčkově zprostředkované izotermické amplifikace v kombinaci s DNA funkcionalizovanými nanočásticemi zlata jako sondami“. PLOS ONE. 11 (3): e0151769. Bibcode:2016PLoSO..1151769A. doi:10.1371 / journal.pone.0151769. PMC  4803327. PMID  27003504.
  10. ^ Arunrut, Narong; Tondee, Benyatip; Khumwan, Pakapreud; Kampeera, Jantana; Kiatpathomchai, Wansika (únor 2021). „Rychlá a citlivá kolorimetrická detekce mikrosporidiánů Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) na základě genu proteinu sporové stěny (SWP) pomocí smyčkově izotermické amplifikace kombinované s DNA funkcionalizovanými nanočásticemi zlata jako sondy“ Akvakultura. 533: 736206. doi:10.1016 / j.akvakultura.2020.736206.
  11. ^ A b Sen K, Ashbolt NJ (2011). Mikrobiologie prostředí: současná technologie a aplikace vody. Norfolk, Velká Británie: Caister Academic Press. ISBN  978-1-904455-70-7.[stránka potřebná ]
  12. ^ Macarthur G (2009). Globální diagnostika zdraví: výzkum, vývoj a regulace. Zpráva z semináře Akademie lékařských věd (PDF). Akademie lékařských věd (Velká Británie). ISBN  978-1-903401-20-0. Archivovány od originál (PDF) dne 2018-05-16. Citováno 2014-05-05.
  13. ^ Geojith G, Dhanasekaran S, Chandran SP, Kenneth J (2011). „Test účinnosti smyčkově izotermické amplifikace (LAMP) pro laboratorní identifikaci izolátů Mycobacterium tuberculosis v omezeném prostředí“. J. Microbiol. Metody. 84 (1): 71–3. doi:10.1016 / j.mimet.2010.10.015. PMID  21047534.
  14. ^ Poon LL, Wong BW, Ma EH, Chan KH, Chow LM, Abeyewickreme W, Tangpukdee N, Yuen KY, Guan Y, Looareesuwan S, Peiris JS (2006). „Citlivý a levný molekulární test na malárii falciparum: detekce DNA Plasmodium falciparum přímo z tepelně upravené krve izotermickou amplifikací zprostředkovanou smyčkou“. Clin. Chem. 52 (2): 303–6. doi:10.1373 / clinchem.2005.057901. PMID  16339303.
  15. ^ Ponaka, Reddy V. a kol. | ASTMH 2015 | Molekulární detekce plazmodia smyčkovou izotermickou amplifikací (LAMP) a srovnání citlivosti na PET-PCR test | http://www.ilmar.org.il/diasorin/MBI_MalariaPoster2015-ASTMH_JT_rev3.pdf Archivováno 2016-11-20 na Wayback Machine
  16. ^ Ponaka, Reddy V. a kol. | AMP 2015 | http://www.ilmar.org.il/diasorin/MBI_AMP2015_MalariaPoster102715.pdf Archivováno 2016-11-20 na Wayback Machine
  17. ^ Njiru ZK, Mikosza AS, Matovu E, Enyaru JC, Ouma JO, Kibona SN, Thompson RC, Ndung'u JM (2008). „Africká trypanosomiáza: citlivá a rychlá detekce podrodu Trypanozoon smyčkovou izotermickou amplifikací (LAMP) parazitické DNA“. Int. J. Parasitol. 38 (5): 589–99. doi:10.1016 / j.ijpara.2007.09.006. PMC  7094514. PMID  17991469.
  18. ^ Walker, Peter (21. května 2020). „Testuje se britský test na přítomnost koronavirů s 20minutovým čekáním“. Opatrovník.
  19. ^ Park, Gun-Soo; Ku, Keunbon; Baek, Seung-Hwa; Kim, Seong-Jun; Kim, Seung Il; Kim, Bum-Tae; Maeng, Jin-Soo (2020). „Vývoj testů izotermické amplifikace zprostředkovaných smyčkou reverzní transkripce zaměřených na syndrom akutního respiračního syndromu koronaviru 2 (SARS-CoV-2)“. The Journal of Molecular Diagnostics. 22 (6): 729–735. doi:10.1016 / j.jmoldx.2020.03.006. PMC  7144851. PMID  32276051.
  20. ^ Curtis KA, Rudolph DL, Owen SM (2008). „Rychlá detekce HIV-1 reverzní transkripcí, smyčkovou izotermickou amplifikací (RT-LAMP)“. J. Virol. Metody. 151 (2): 264–70. doi:10.1016 / j.jviromet.2008.04.011. PMID  18524393.
  21. ^ Sattabongkot J, Tsuboi T, Han ET, Bantuchai S, Buates S (2014). „Test izotermické amplifikace zprostředkovaný smyčkou pro rychlou diagnostiku maláriových infekcí v oblasti endemicity v Thajsku“. J. Clin. Microbiol. 52 (5): 1471–7. doi:10.1128 / JCM.03313-13. PMC  3993686. PMID  24574279.
  22. ^ Francois P, Tangomo M, Hibbs J, Bonetti EJ, Boehme CC, Notomi T, Perkins MD, Schrenzel J (2011). „Robustnost smyčkově zprostředkované izotermické amplifikační reakce pro diagnostické aplikace“. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 62 (1): 41–8. doi:10.1111 / j.1574-695X.2011.00785.x. PMID  21276085.
  23. ^ Torres C, Vitalis EA, Baker BR, Gardner SN, Torres MW, Dzenitis JM (2011). „LAVA: open-source přístup k navrhování podpisů DNA LAMP (loop-mediated isothermal amplification) DNA“. BMC bioinformatika. 12: 240. doi:10.1186/1471-2105-12-240. PMC  3213686. PMID  21679460.
  24. ^ Iseki, Hiroši; Alhassan, Andy; Ach, Naomi; Thekisoe, Oriel M.M .; Yokoyama, Naoaki; Inoue, Noboru; Nambota, Andrew; Yasuda, červen; Igarashi, Ikuo (prosinec 2007). "Vývoj metody multiplexní smyčky zprostředkované izotermické amplifikace (mLAMP) pro současnou detekci bovinních parazitů Babesia". Časopis mikrobiologických metod. 71 (3): 281–7. doi:10.1016 / j.mimet.2007.09.019. PMID  18029039.
  25. ^ Tanner NA, Zhang Y, Evans TC (srpen 2012). „Simultánní detekce více cílů v izotermickém zesílení zprostředkovaném smyčkou v reálném čase“. Biotechniky. 53 (2): 81–9. doi:10.2144/0000113902. PMID  23030060.