Transfekce RNA - RNA transfection - Wikipedia

Viz také: RNA vakcína a Transfekce

Transfekce RNA je proces záměrného zavádění RNA na živobytí buňka. RNA může být purifikována z buněk po lýza nebo syntetizovány zdarma nukleotidy buď chemicky, nebo enzymaticky pomocí RNA polymeráza na přepsat A DNA šablona. Stejně jako u DNA lze RNA dodávat do buněk různými způsoby, včetně mikroinjekce, elektroporace, a lipidem zprostředkovaná transfekce. Pokud RNA kóduje a protein, transfektované buňky mohou přeložit RNA do kódovaného proteinu. Pokud je RNA regulační RNA (např miRNA ), RNA může způsobit další změny v buňce (např Knodown zprostředkovaný RNAi ).

Zapouzdření molekuly RNA v lipidové nanočástice byl průlom pro výrobu životaschopných RNA vakcíny, řešení řady klíčových technických překážek při dodávání molekuly RNA do lidské buňky.[1]

Terminologie

Molekuly RNA kratší než asi 25nt se z velké části vyhýbají detekci vrozený imunitní systém, který je spouštěn delšími molekulami RNA. Většina buněk v těle exprimuje proteiny vrozeného imunitního systému a po expozici exogenním dlouhým molekulám RNA tyto proteiny iniciují signální kaskády, které vedou k zánět. Tento zánět hypersenzitizuje exponovanou buňku a blízké buňky na následnou expozici. Výsledkem je, že zatímco buňka může být opakovaně transfekována krátkou RNA s několika nespecifickými účinky, opakovaná transfekce buněk i s malým množstvím dlouhé RNA může způsobit buněčnou smrt, pokud nebudou přijata opatření k potlačení nebo úniku vrozeného imunitního systému (viz „Transfekce s dlouhou RNA“ níže).

Transfekce krátkou RNA

Transfekce krátkých RNA se běžně používá v biologickém výzkumu ke sražení exprese požadovaného proteinu (s použitím siRNA ) nebo k vyjádření či blokování činnosti a miRNA (pomocí krátké RNA, která působí nezávisle na buňce RNAi stroje, a proto se neoznačuje jako siRNA). Zatímco vektory na bázi DNA (viry, plazmidy ), které kódují krátkou molekulu RNA, lze také použít, transfekce krátkou RNA neriskuje modifikaci DNA buňky, což je vlastnost, která vedla k vývoji krátké RNA jako nové třídy makromolekulární léky.[2]

Transfekce s dlouhou RNA

Transfekce s dlouhou RNA je proces záměrného zavádění molekul RNA delší než asi 25nt do živých buněk. Rozlišuje se transfekce krátkou a dlouhou RNA, protože exogenní dlouhé molekuly RNA vyvolávají an vrozená imunitní odpověď v buňkách, které mohou způsobit řadu nespecifických účinků včetně překlad blok, buněčný cyklus zatčení a apoptóza.

Endogenní vs. exogenní dlouhá RNA

Vrozený imunitní systém se vyvinul, aby chránil před infekce detekcí s patogeny spojené molekulární vzorce (PAMP) a spuštění komplexní sady odpovědí kolektivně známých jako „zánět “. Mnoho buněk vyjadřuje specifické receptory rozpoznávání vzoru (PRR) pro exogenní RNA včetně mýtný receptor 3,7,8 (TLR3, TLR7, TLR8 ),[3][4][5][6] RNA helikáza RIG1 (RARRES3),[7] protein kináza R. (PKR, aka EIF2AK2),[8][9] členové rodiny proteinů oligoadenylát syntetázy (OAS1, OAS2, OAS3 ), a další. Všechny tyto proteiny se mohou specificky vázat na exogenní molekuly RNA a spouštět imunitní reakci. Specifické chemické, strukturní nebo jiné vlastnosti dlouhých molekul RNA, které jsou vyžadovány pro rozpoznání PRR, zůstávají navzdory intenzivnímu studiu do značné míry neznámé. V danou dobu typická savčí buňka může obsahovat několik set tisíc mRNA a další, regulační dlouhá RNA molekuly. Jak buňky rozlišují exogenní dlouhou RNA od velkého množství endogenní dlouhé RNA, je důležitou otevřenou otázkou buněčná biologie. Několik zpráv to naznačuje fosforylace 5'-konce dlouhé molekuly RNA může ovlivnit její imunogenicita a konkrétně ta 5'-trifosfátová RNA, která může být produkována během virové infekce, je více imunogenní než 5'-difosfátová RNA, 5'-monofosfátová RNA nebo RNA neobsahující žádný 5 'fosfát.[10][11][12][13][14][15] Avšak in vitro transkribovaná (ivT) dlouhá RNA obsahující a 7-methylguanosinový uzávěr (předložit eukaryotický mRNA) je také vysoce imunogenní, přestože nemá 5 'fosfát,[16] což naznačuje, že jiné vlastnosti než 5'-fosforylace mohou ovlivnit imunogenicitu molekuly RNA.

Eukaryotická mRNA obsahuje chemicky modifikované nukleotidy, jako jsou N6-methyladenosin, 5-methylcytidin, a 2'-O-methylovaný nukleotidy. Ačkoli je v typické molekule mRNA přítomen jen velmi malý počet těchto modifikovaných nukleotidů, mohou pomoci zabránit mRNA v aktivaci přirozeného imunitního systému narušením sekundární struktura která by připomínala dvouvláknovou RNA (dsRNA),[5] typ RNA, o kterém se předpokládá, že je v buňkách přítomen pouze během virové infekce. Imunogenicita dlouhé RNA byla použita ke studiu jak vrozených, tak adaptivní imunita.

Opakovaná transfekce dlouhé RNA

Inhibuje pouze tři proteiny, interferon-p, STAT2, a EIF2AK2 stačí k záchraně člověka fibroblasty od buněčné smrti způsobené častou transfekcí s dlouhou RNA kódující protein.[16] Inhibice signalizace interferonu narušuje smyčku pozitivní zpětné vazby, která normálně hypersenzitizuje buňky vystavené exogenní dlouhé RNA. Vědci nedávno použili tuto techniku ​​k vyjádření přeprogramování proteinů u primárního člověka fibroblasty.[17]

Viz také

Reference

  1. ^ Cooney, Elizabeth (1. prosince 2020). „Jak nanotechnologie pomáhá očkování mRNA vakcínami Covid-19“. Stat. Citováno 3. prosince 2020.
  2. ^ Tansey B (11. srpna 2006). „Léčba makulární degenerace interferuje se zprávami RNA“. San Francisco Chronicle.
  3. ^ Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA (2001). „Rozpoznání dvouvláknové RNA a aktivace NF-kappaB receptorem podobným Toll 3“. Příroda. 413 (6857): 732–738. doi:10.1038/35099560. PMID  11607032. S2CID  4346537.
  4. ^ Kariko K, Ni H, Capodici J, Lamphier M, Weissman D (2004). „mRNA je endogenní ligand pro Toll-like receptor 3“. J Biol Chem. 279 (13): 12542–12550. doi:10,1074 / jbc.M310175200. PMID  14729660.
  5. ^ A b Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D (2005). „Potlačení rozpoznávání RNA receptory podobnými Toll: dopad modifikace nukleosidů a evoluční původ RNA“. Imunita. 23 (2): 165–175. doi:10.1016 / j.immuni.2005.06.008. PMID  16111635.
  6. ^ Diebold SS, Kaisho T, Hemmi H, Akira S, Reis e Sousa C (2004). „Vrozené antivirové reakce pomocí rozpoznávání jednovláknové RNA zprostředkované TLR7“. Věda. 303 (5663): 1529–1531. doi:10.1126 / science.1093616. PMID  14976261. S2CID  33144196.
  7. ^ Yoneyama M, Kikuchi M, Natsukawa T, Shinobu N, Imaizumi T a kol. (2004). „RNA helikáza RIG-I má zásadní funkci při dvouvláknových vrozených antivirových reakcích indukovaných RNA“. Nat Immunol. 5 (7): 730–737. doi:10.1038 / ni1087. PMID  15208624. S2CID  34876422.
  8. ^ Das HK, Das A, Ghosh-Dastidar P, Ralston RO, Yaghmai B, et al. (1981). "Syntéza proteinů v králičích retikulocytech. Čištění a charakterizace inhibitoru syntézy proteinů s dvojitým řetězcem závislým na RNA z lyzátů retikulocytů". J Biol Chem. 256 (12): 6491–6495. PMID  7240221.
  9. ^ Levin DH, Petryshyn R, London IM (1981). "Charakterizace purifikované dvouvláknové RNA aktivované eIF-2 alfa kinázy z králičích retikulocytů". J Biol Chem. 256 (14): 7638–7641. PMID  6265457.
  10. ^ Hornung V, Ellegast J, Kim S, Brzozka K, Jung A a kol. (2006). „5'-trifosfátová RNA je ligandem pro RIG-I“. Věda. 314 (5801): 994–997. doi:10.1126 / science.1132505. PMID  17038590. S2CID  22436759.
  11. ^ Saito T; Owen DM; Jiang F; Marcotrigiano J; Gale M, Jr. (2008). „Vrozená imunita vyvolaná rozpoznáváním RNA viru hepatitidy C v závislosti na složení RIG-I“. Příroda. 454 (7203): 523–527. doi:10.1038 / nature07106. PMC  2856441. PMID  18548002.
  12. ^ Takahasi K, Yoneyama M, Nishihori T, Hirai R, Kumeta H a kol. (2008). „Mechanismus nesnímání RNA helikázy RIG-I a aktivace antivirových imunitních odpovědí“. Mol Cell. 29 (4): 428–440. doi:10.1016 / j.molcel.2007.11.028. PMID  18242112.
  13. ^ Yoneyama M, Fujita T (2008). "Strukturální mechanismus rozpoznávání RNA receptory typu RIG-I". Imunita. 29 (2): 178–181. doi:10.1016 / j.immuni.2008.07.009. PMID  18701081.
  14. ^ Schmidt A, Schwerd T, Hamm W, Hellmuth JC, Cui S a kol. (2009). „5'-trifosfátová RNA vyžaduje pro aktivaci antivirové signalizace pomocí RIG-I struktury spárované se bázemi“. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (29): 12067–12072. doi:10.1073 / pnas.0900971106. PMC  2705279. PMID  19574455.
  15. ^ Schlee M, Roth A, Hornung V, Hagmann CA, Wimmenauer V, et al. (2009). „Rozpoznání 5'-trifosfátu helikázou RIG-I vyžaduje krátkou tupou dvouvláknovou RNA obsaženou v pásu viru negativních řetězců“. Imunita. 31 (1): 25–34. doi:10.1016 / j.immuni.2009.05.008. PMC  2824854. PMID  19576794.
  16. ^ A b Angel M, Yanik MF (2010). „Vrozená potlačení imunity umožňuje častou transfekci pomocí RNA kódujících přeprogramování proteinů“. PLOS ONE. 5 (7): e11756. doi:10.1371 / journal.pone.0011756. PMC  2909252. PMID  20668695.
  17. ^ Trafton A (26. července 2010). „RNA nabízí bezpečnější způsob přeprogramování buněk“. Zpravodajská kancelář MIT.

externí odkazy