In vitro rekombinace - In vitro recombination

Tento článek má několik problémů. Prosím pomozte vylepši to nebo diskutovat o těchto otázkách na internetu diskusní stránka. (Zjistěte, jak a kdy tyto zprávy ze šablony odebrat) Tento článek může vyžadovat vyčištění setkat se s Wikipedií standardy kvality. Specifický problém je: Obecné formátování na WP: MOS Prosím pomozte vylepšit tento článek jestli můžeš. (Prosinec 2012) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) tento článek mohou mít příliš mnoho záhlaví oddílů dělících jeho obsah. Pomozte nám vylepšit článek sloučením podobných sekcí a odstraněním nepotřebných podnadpisů. (Prosinec 2012) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) The hlavní část tohoto článku možná bude třeba přepsat. Použijte průvodce rozvržením elektrody zajistit, aby tato část dodržovala normy Wikipedie a obsahovala všechny důležité podrobnosti. (Února 2018) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) tento článek potřebuje další citace pro ověření. Prosím pomozte vylepšit tento článek podle přidávání citací ke spolehlivým zdrojům. Zdroj bez zdroje může být napaden a odstraněn. Najít zdroje: „In vitro rekombinace“  – zprávy  · noviny  · knihy  · učenec  · JSTOR (Únor 2016) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony)

Rekombinace DNA (molekulární klonování)

Rekombinantní DNA (rDNA) nebo molekulární klonování, je proces, kterým jediný gen nebo část DNA, je izolovaný a zesílený. Rekombinantní DNA je také známá jako rekombinace in vitro. A klonovací vektor je molekula DNA, která přenáší cizí DNA do a hostitelská buňka, kde se replikuje a produkuje mnoho svých kopií spolu s cizí DNA. Existuje mnoho typů klonovacích vektorů plazmidy a fágy. Aby bylo možné provést rekombinaci mezi vektorem a cizí DNA, je nutné vektor a DNA klonovat trávení, ligujte cizí DNA do vektoru s enzymovou DNA ligáza. A DNA je vložena zavedením DNA do bakteriálních buněk pomocí proměna.

Příprava cizí DNA

Existují dva hlavní zdroje cizí DNA pro molekulární klonování genomová DNA (gDNA) a doplňkovou (nebo kopírovací) DNA (cDNA). Molekuly cDNA jsou DNA kopie mRNA vyrobené molekuly in vitro působením enzymu reverzní transkriptáza. Pro získání cDNA pro specifický gen je nejprve nutné zkonstruovat a cDNA knihovna.

Fragmentující gDNA

Zajímavá DNA musí být roztříštěný poskytnout relevantní segment DNA vhodné velikosti. Příprava fragmentů DNA pro klonování se provádí pomocí PCR, ale lze toho dosáhnout také restrikční enzym trávení a frakcionace podle Gelová elektroforéza.

Příprava knihoven cDNA

cDNA knihovny

Při přípravě cDNA knihovny je prvním krokem izolace celkové mRNA z požadovaného buněčného typu. Poté se enzymová reverzní transkriptáza použije ke generování cDNA. Reverzní transkriptáza je RNA-dependentní DNA polymeráza. Závisí to na přítomnosti primeru, obvykle poly-dT oligonukleotid, připravit Syntéza DNA. DNA polymeráza může tyto jednovláknové primery použít k zahájení syntézy DNA druhého vlákna na šablonách mRNA. Poté, co jsou jednořetězcové molekuly DNA převedeny na dvouřetězcové molekuly DNA pomocí DNA polymerázy, jsou vloženy do vektorů a klonovány. K tomu jsou cDNA často methylovány specifickou methyltransferázou. Tyto syntetické oligonukleotidy mohou být buď „linkery“, přesahy jsou generovány štěpením příslušným restrikčním enzymem.

Plazmidový vektor

Plazmidový vektor

Rekombinantní vektory DNA fungují jako nosiče cizí DNA. Plazmidy jsou malé molekuly uzavřeného kruhu DNA, které existují z chromozomy jejich hostitele. Jejich replikace má být pod přísnou kontrolou (nízký počet kopií) nebo uvolněná (vysoký počet kopií). Restrikční místa, nazývaná vícenásobná klonovací stránka nebo polylinker, poskytují široký výběr restrikčních míst pro použití v klonovacím kroku.

Reference

Mark F. Wiser, „Přednášky pro metody v buněčné biologii

Tento molekulární biologie článek je a pahýl. Wikipedii můžete pomoci pomocí rozšiřovat to.