Několik klonovacích stránek - Multiple cloning site - Wikipedia

Klonovací vektor pUC19 ukazující sekvenci více klonovacích míst s místy restrikčních enzymů.

A více klonovacích stránek (MCS), také nazývaný a polylinker, je krátký segment DNA který obsahuje mnoho (až ~ 20) restrikční weby - standardní funkce navržená plazmidy.[1] Restrikční místa v MCS jsou typicky jedinečná a vyskytují se pouze jednou v daném plazmidu. Účelem MCS v plazmidu je umožnit vložení části DNA do této oblasti.[2] MCS se nachází v různých vektorech, včetně klonovací vektory zvýšit počet kopií cílové DNA a v expresní vektory k vytvoření bílkovinného produktu.[3] Ve vektorech exprese je MCS umístěn po proudu od promotér.[2]

Vytvoření více klonovacích stránek

V některých případech nemusí vektor obsahovat MCS. Spíše lze k vektoru přidat MCS.[4] Prvním krokem je návrh doplňkového oligonukleotid sekvence, které obsahují restrikční enzym místa spolu s dalšími bázemi na konci, které se doplňují k vektoru po štěpení. Potom mohou být oligonukleotidové sekvence hybridizovány a ligovány do štěpeného a purifikovaného vektoru. Štěpený vektor se štěpí restrikčním enzymem, který doplňuje přesahy oligonukleotidového inzertu. Po ligaci transformujte vektor na bakterie a ověřte inzert sekvenováním. Tuto metodu lze také použít k přidání nových restrikčních míst do více klonovacích stránek.

Diagram ukazující proces inzerce více klonovacích míst do plazmidového vektoru.

Použití

Více klonovacích míst je funkce, která umožňuje inzerci cizí DNA bez narušení zbytku plazmidu, což je velmi užitečné při biotechnologie, bioinženýrství, a molekulární genetika.[1] MCS může pomoci při výrobě transgenních organismů, běžněji známých jako a geneticky upravený organismus (GMO) využívající genetické inženýrství. Aby bylo možné využít výhody MCS v genetickém inženýrství, je třeba do vektoru přidat požadovaný gen během produkce, když je MCS rozříznut.[5] Poté, co je MCS vyroben a ligován, bude obsahovat požadovaný gen a může být amplifikován ke zvýšení počtu kopií genů v bakteriálním hostiteli. Po replikaci bakterie může být požadovaný gen extrahován z bakterie. V některých případech lze k vytvoření proteinového produktu použít expresní vektor. Poté, co jsou produkty izolovány, mají širokou škálu použití, jako je výroba inzulín, vytvoření vakcíny, produkce antibiotika a tvorba genových terapií.

Příklad

Jeden bakteriální plazmid používaný v genetickém inženýrství jako plazmidový klonovací vektor je pUC18. Jeho polylinkerová oblast je složena z několika rozpoznávacích míst restrikčních enzymů, která byla vytvořena do jednoho klastru (polylinker). Má restrikční místa pro různé restrikční enzymy, včetně EcoRI, BamHI, a PstI. Dalším vektorem používaným v genetickém inženýrství je pUC19, který je podobný pUC18, ale jeho polylinkerová oblast je obrácená. E-coli se také běžně používá jako bakteriální hostitel kvůli dostupnosti, rychlému růstu a všestrannosti.[6]

Za účelem genetického inženýrství inzulínu je prvním krokem štěpení MCS v použitém plazmidu.[7] Jakmile je MCS rozříznut, může být přidán gen pro lidský inzulín, čímž je plazmid geneticky modifikován. Poté se geneticky modifikovaný plazmid vloží do bakteriálního hostitele a nechá se rozdělit. Aby byla zajištěna velká nabídka, která je požadována, jsou hostitelské buňky vloženy do velké fermentační nádrže, která je pro hostitele optimálním prostředím. Proces je ukončen odfiltrováním inzulínu z hostitele. Poté může proběhnout čištění, aby mohl být inzulin zabalen a distribuován jednotlivcům s diabetem.

Reference

  1. ^ A b Clark DP (2005). Molekulární biologie. Akademický tisk. p. 611. ISBN  0-12-175551-7.
  2. ^ A b „Addgene: Co je to plazmid?“. www.addgene.org. Citováno 2018-04-29.
  3. ^ Carter, Shieh, Matt, Jennifer (2015). Průvodce výzkumnými technikami v neurovědě. Elsevier. 219–237.
  4. ^ „How to create a pefect MCS“ (PDF). Addgene. 2018-04-28.
  5. ^ „BBC - Standard Grade Bitesize Biology - Reprogramming microbes: Revision, Page 2“. Citováno 2018-04-29.
  6. ^ "Nástroje genetického inženýrství | Neomezená mikrobiologie". courses.lumenlearning.com. Citováno 2018-04-29.
  7. ^ „Co je to genetické inženýrství?“. Citováno 2018-04-29.