GFP-cDNA - GFP-cDNA - Wikipedia
 | tento článek příliš spoléhá na Reference na primární zdroje. (Listopadu 2008) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) |
| tento článek potřebuje další citace pro ověření. (Listopadu 2008) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) |
The GFP-cDNA projekt dokumentuje lokalizaci bílkoviny do subcelulárních oddílů eukaryotický buňka přihlašování fluorescenční mikroskopie. Experimentální data jsou doplněna o bioinformatické analýzy a publikovány online v a databáze. Funkce vyhledávání umožňuje najít proteiny obsahující znaky nebo motivy zvláštního zájmu. Na projektu se podílejí výzkumné skupiny Rainer Pepperkok na Evropská laboratoř molekulární biologie (EMBL) a Stefan Wiemann na Německé centrum pro výzkum rakoviny (DKFZ).
Jaké experimenty se provádějí?
The cDNA identifikovaného románu Otevřete rámečky na čtení (ORF) jsou označeny Zelený fluorescenční protein (GFP) a exprimován v eukaryotických buňkách. Následně subcelulární lokalizace fúzní proteiny se zaznamenává fluorescenční mikroskopií.
Kroky:
1. Klonování ve velkém měřítku
Jakákoli rozsáhlá manipulace s ORF vyžaduje klonování technologie, které jsou zdarma restrikční enzymy. V tomto ohledu ty, které využívají rekombinace klonování (Gateway of Invitrogen nebo Creator of BD Biosciences) se ukázaly jako nejvhodnější. Tato technologie klonování je založena na rekombinačních mechanismech používaných fágy integrovat jejich DNA do hostitele genom. Umožňuje rychlé a pohodlné převádění ORF mezi funkčně užitečné vektory bez nutnosti konvenčního restrikčního klonování. V projektu cDNA-GFP jsou přenášeny ORF CFP / YFP výraz vektory. Pro analýzu lokalizace jsou generovány fúze N- a C-terminálu. Tím se maximalizuje možnost správného určení lokalizace, protože přítomnost GFP se může maskovat zaměřovací signály které mohou být přítomny na jednom konci nativního proteinu.
N-koncové fluorescenční fúze
Vložte požadovaný gen do MCS před genem fluorescenčního proteinu a exprimujte svůj gen jako fúzi s N-koncem fluorescenčního proteinu.
C-terminální fluorescenční fúze
Vložte požadovaný gen do MCS za genem fluorescenčního proteinu a exprimujte svůj gen jako fúzi s C-koncem fluorescenčního proteinu.
2. Transfekce eukaryotických buněk, exprese
Fúzní vektory se transfektují do buněk Vero (opičí ledviny fibroblasty ). Obzvláště zajímavé ORF jsou také testovány na lokalizaci v buňkách PC12 a hipokampální neurony.
3. Lokalizace proteinů
V různých časových bodech se subcelulární lokalizace fúzních proteinů zaznamenává pomocí fluorescenční mikroskopie. Na konci zobrazování živých buněk lze buňky stále fixovat a provádět kolokační experimenty.
4. Bioinformatická analýza
Jelikož je známá sekvence cDNA, může bioinformatika předpovídat lokalizaci a funkci kódovaného proteinu. Bioinformatickou analýzu usnadňuje bioinformatický vyhledávač Kombajn.
5. Přiřazení kategorie subcelulární lokalizace
Vyhodnocují se výsledky fúzí N- a C-terminálu a tyto údaje jsou následně srovnávány s bioinformatickými předpovědi. Konečná subcelulární lokalizace (z přibližně 20 kategorií) je poté přiřazena každému ORF. Podobné lokalizace jak s N-, tak s C-koncovými konstrukty poskytují vyšší stupeň spolehlivosti výsledku. U těch ORF, kde tyto dvě fúze neposkytují podobný model lokalizace, se uvažuje o řadě dalších kritérií, včetně bioinformatických předpovědí. Jasnou lokalizaci nelze občas přiřadit.
Které údaje se zveřejňují?
Každý datový list obsahuje fluorescenční obrazy fúzí N- a C-terminálu, přiřazenou lokalizaci, další lokalizace, komentáře a Swissprot ID. Pro každou položku proteinu je poskytnut odkaz na odpovídající Kombajn stránka bioinformatiky.
Jak mohu použít databázi GFP-cDNA?
Fotografie všech lokalizovaných proteinů a jejich bioinformatickou analýzu lze zobrazit pomocí tlačítek „Tabulka výsledků“ nebo „Výsledky obrázků“. Kromě toho použijte vyhledávací okno na zadávací stránce k vyhledání proteinů obsahujících rysy nebo motivy, které vás zajímají a které byly v tomto projektu lokalizovány.