DNA sekvencer - DNA sequencer
![]() DNA sekvencery | |
Výrobci | Roche, Illumina, Life Technologies, Beckman Coulter, Pacific Biosciences, MGI / BGI, Oxford Nanopore Technologies |
---|
A DNA sekvencer je vědecký nástroj slouží k automatizaci Sekvenování DNA proces. Vzhledem k vzorku DNA se k určení pořadí čtyř bází používá sekvencer DNA: G (guanin ), C (cytosin ), A (adenin ) a T (tymin ). To je poté hlášeno jako text tětiva volal čtení. Lze také uvažovat o některých sekvencerech DNA optické přístroje protože analyzují světelné signály pocházející z fluorochromy připojený k nukleotidy.
První automatizovaný sekvencer DNA, který vynalezl Lloyd M. Smith, byl představen Applied Biosystems v roce 1987.[1] Využilo to Sangerovo sekvenování metoda, technologie, která tvořila základ „první generace“ sekvencerů DNA[2][3] a umožnil dokončení projekt lidského genomu v roce 2001.[4] Tato první generace DNA sekvencerů je v podstatě automatizovaná elektroforéza systémy, které detekují migraci značených fragmentů DNA. Proto tyto sekvencery mohou být také použity v genotypizace genetických markerů, kde je třeba určit pouze délku fragmentu DNA (fragmentů) (např. mikrosatelity, AFLP ).
The Projekt lidského genomu podnítil vývoj levnějších, vysoce výkonných a přesnějších platforem známých jako Sekvencery nové generace (NGS) k pořadí lidský genom. Patří mezi ně 454, Pevný a Illumina Platformy pro sekvenování DNA. Sekvenční stroje nové generace podstatně zvýšily rychlost sekvenování DNA ve srovnání s předchozími metodami Sanger. Vzorky DNA lze připravit automaticky za pouhých 90 minut,[5] zatímco lidský genom může být sekvenován při 15násobném pokrytí během několika dní.[6]
Novější sekvenátory DNA třetí generace, jako např SMRT a Oxford Nanopore změřte přidání nukleotidů k jedné molekule DNA v reálném čase.
Kvůli omezením v technologii DNA sekvenceru jsou tato čtení krátká ve srovnání s délkou a genom proto musí být čtení sestaven na delší kontigy.[7] Data mohou také obsahovat chyby způsobené omezeními v technice sekvenování DNA nebo chybami během Amplifikace PCR. Výrobci DNA sekvenceru používají k detekci přítomných bází DNA řadu různých metod. Specifické protokoly používané v různých platformách pro sekvenování mají dopad na výsledná data, která jsou generována. Proto může být porovnávání kvality dat a nákladů mezi různými technologiemi skličující úkol. Každý výrobce poskytuje své vlastní způsoby, jak informovat o chybách a skóre sekvenování. Chyby a skóre mezi různými platformami však nelze vždy přímo porovnávat. Vzhledem k tomu, že se tyto systémy spoléhají na různé přístupy k sekvenování DNA, výběr nejlepšího sekvenátoru a metody DNA bude obvykle záviset na cílech experimentu a dostupném rozpočtu.[2]
Dějiny
První Sekvenování DNA metody byly vyvinuty Gilbertem (1973)[8] a Sanger (1975).[9] Gilbert představil metodu sekvenování založenou na chemické modifikaci DNA s následným štěpením na specifických bázích, zatímco Sangerova technika je založena na dideoxynukleotid ukončení řetězce. Metoda Sanger se stala populární díky své zvýšené účinnosti a nízké radioaktivitě. První automatizovaný DNA sekvencer byl AB370A, představený v roce 1986 Applied Biosystems. AB370A dokázal sekvenovat 96 vzorků současně, 500 kilobází za den a dosahoval délky čtení až 600 bází. To byl začátek „první generace“ sekvencerů DNA,[2][3] který implementoval Sangerovo sekvenování, fluorescenční dideoxy nukleotidy a polyakrylamidový gel vložený mezi skleněné desky - deskové gely. Dalším významným pokrokem bylo uvolnění AB310 v roce 1995, který používal lineární polymer v kapiláře místo deskového gelu pro separaci řetězců DNA elektroforézou. Tyto techniky tvořily základ pro dokončení projektu lidského genomu v roce 2001.[4] Projekt lidského genomu podnítil vývoj levnějších, vysoce výkonných a přesnějších platforem známých jako Next Generation Sequencer (NGS). V roce 2005 454 biologických věd v roce 2006 vydal 454 sekvencer, následovaný Solexa Genome Analyzer a SOLiD (Supported Oligo Ligation Detection) od Agencourt v roce 2006. Společnost Applied Biosystems získala Agencourt v roce 2006 a v roce 2007, Roche koupil 454 Life Sciences, zatímco Illumina koupil Solexa. Ion Torrent vstoupil na trh v roce 2010 a získal jej společnost Life Technologies (nyní Thermo Fisher Scientific). A BGI zahájila výrobu sekvencerů v Číně po získání Kompletní genomika pod jejich MGI paže. Stále jde o nejběžnější systémy NGS kvůli jejich konkurenčním nákladům, přesnosti a výkonu.
Více nedávno byla představena třetí generace sekvencerů DNA. Metody sekvenování použité těmito sekvenátory nevyžadují amplifikaci DNA (polymerázová řetězová reakce - PCR), což urychluje přípravu vzorku před sekvenováním a snižuje chyby. Kromě toho se údaje o sekvenování shromažďují z reakcí způsobených přidáním nukleotidů do komplementárního řetězce v reálném čase. Dvě společnosti představily ve svých řadičích třetí generace různé přístupy. Pacific Biosciences sekvencery využívají metodu nazvanou Single-molecule real-time (SMRT), kde jsou data o sekvenování vytvářena světlem (zachyceným kamerou) emitovaným, když je nukleotid přidán do komplementárního řetězce enzymy obsahujícími fluorescenční barviva. Oxford Nanopore Technologies je další společnost vyvíjející sekvencery třetí generace využívající elektronické systémy založené na technologiích snímání nanopórů.
Výrobci sekvencerů DNA
Sekvencery DNA byly vyvinuty, vyrobeny a prodány mimo jiné následujícími společnostmi.
Roche
Sekvencer 454 DNA byl prvním sekvencerem nové generace, který se stal komerčně úspěšným.[10] Byl vyvinut společností 454 Life Sciences a zakoupen společností Roche v roce 2007. 454 využívá detekci pyrofosfátu uvolněného DNA polymerázovou reakcí při přidání nukleotidu do templátového kmene.
Roche v současné době vyrábí dva systémy založené na své technologii pyrosekvenování: GS FLX + a GS Junior System.[11] Systém GS FLX + slibuje délky čtení přibližně 1000 párů bází, zatímco systém GS Junior slibuje čtení 400 základních párů.[12][13] Předchůdce GS FLX +, systém 454 GS FLX Titanium, byl vydán v roce 2008 a dosáhl výstupu 0,7 G dat na běh, s přesností 99,9% po kvalitním filtru a délkou čtení až 700 bp. V roce 2009 uvedla společnost Roche na trh GS Junior, stolní verzi sekvenceru 454 s délkou čtení až 400 bp a zjednodušenou přípravou knihovny a zpracováním dat.
Jednou z výhod 454 systémů je jejich rychlost běhu, Manpower lze snížit automatizací přípravy knihovny a poloautomatizací emulzní PCR. Nevýhodou systému 454 je, že je náchylný k chybám při odhadu počtu bází v dlouhém řetězci identických nukleotidů. Toto se označuje jako chyba homopolymeru a nastává, když je v řadě 6 nebo více identických bází.[14] Další nevýhodou je, že cena činidel je relativně dražší ve srovnání s jinými sekvencery nové generace.
V roce 2013 společnost Roche oznámila, že zastaví vývoj technologie 454 a v roce 2016 úplně vyřadí 454 strojů.[15][16]
Společnost Roche vyrábí řadu softwarových nástrojů, které jsou optimalizovány pro analýzu 454 sekvenčních dat.[17] GS Run Processor[18] převádí nezpracované obrázky generované sekvenčním spuštěním na hodnoty intenzity. Proces se skládá ze dvou hlavních kroků: zpracování obrazu a zpracování signálu. Software také aplikuje normalizaci, korekci signálu, volání základny a skóre kvality pro jednotlivá čtení. Software poskytuje data ve formátu Standard Flowgram Format (nebo SFF) pro použití v aplikacích pro analýzu dat (GS De Novo Assembler, GS Reference Mapper nebo GS Amplicon Variant Analyzer). GS De Novo Assembler je nástroj pro de novo shromáždění celých genomů o velikosti až 3 GB z brokovnice čte samostatně nebo v kombinaci se spárovanými koncovými daty generovanými 454 sekvencery. Podporuje také sestavení přepisů de novo (včetně analýzy) a také detekci variant izoformy.[17] GS Reference Mapper mapuje krátká čtení na referenční genom a generuje konsenzuální sekvenci. Tento software je schopen generovat výstupní soubory pro posouzení, označující vložení, odstranění a SNP. Zvládne velké a složité genomy jakékoli velikosti.[17] Nakonec analyzátor variant GS Amplicon srovnává čtení ze vzorků amplikonu s referencí a identifikuje varianty (spojené nebo ne) a jejich frekvence. Lze jej také použít k detekci neznámých a nízkofrekvenčních variant. Zahrnuje grafické nástroje pro analýzu zarovnání.[17]
Illumina
Illumina vyrábí řadu sekvenčních strojů nové generace pomocí technologie získané z Manteia Predictive Medicine a vyvinutý společností Solexa.[19] Illumina vyrábí řadu sekvenčních strojů nové generace využívajících tuto technologii, včetně HiSeq, Genome Analyzer IIx, MiSeq a HiScanSQ, které mohou také zpracovávat mikročipy.[20]
Technologie vedoucí k těmto sekvencerům DNA byla poprvé vydána společností Solexa v roce 2006 jako analyzátor genomu.[10] Společnost Illumina zakoupila Solexu v roce 2007. Analyzátor genomu používá sekvenování metodou syntézy. První model vyprodukoval 1G za běh. V průběhu roku 2009 se výkon zvýšil z 20G na běh v srpnu na 50G na běh v prosinci. V roce 2010 společnost Illumina uvedla HiSeq 2000 s výkonem 200 a poté 600 G na běh, což by trvalo 8 dní. Při svém vydání poskytl HiSeq 2000 jednu z nejlevnějších sekvenčních platforem v hodnotě 0,02 $ za milion bází, jak to stojí Pekingský institut pro genomiku.
V roce 2011 společnost Illumina vydala stolní sekvencer s názvem MiSeq. Při jeho vydání mohl MiSeq generovat 1,5 G na běh se spárovanými koncovými 150 bp čteními. Sekvenční běh lze provést za 10 hodin při použití automatizované přípravy vzorku DNA.[10]
Illumina HiSeq používá dva softwarové nástroje k výpočtu počtu a polohy klastrů DNA k hodnocení kvality sekvenování: řídicí systém HiSeq a analyzátor v reálném čase. Tyto metody pomáhají posoudit, zda blízké klastry vzájemně interferují.[10]
Life Technologies
Life Technologies (nyní Thermo Fisher Scientific) produkuje DNA sekvencery pod Applied Biosystems a Ion Torrent značky. Společnost Applied Biosystems vytváří platformu sekvenování příští generace SOLiD,[21] a Sangerovy sekvencery DNA, jako je 3500 Genetic Analyzer.[22] Pod značkou Ion Torrent vyrábí Applied Biosystems čtyři sekvencery nové generace: Ion PGM System, Ion Proton System, Ion S5 a Ion S5xl systems.[23] Společnost také předpokládá, že vyvíjí svůj nový kapilární DNA sekvencer s názvem SeqStudio, který bude vydán počátkem roku 2018.[24]
Systémy SOLiD získala společnost Applied Biosystems v roce 2006. SOLiD aplikuje sekvenování pomocí ligace a duální kódování. První systém SOLiD byl spuštěn v roce 2007 a generuje délku čtení 35 bp a 3G data na běh. Po pěti upgradech byl v roce 2010 vydán systém sekvenování 5500xl, který podstatně zvýšil délku čtení na 85bp, zlepšil přesnost až na 99,99% a produkoval 30G za 7denní běh.[10]
Omezená délka čtení SOLiD zůstala významným nedostatkem[25] a do určité míry omezil jeho použití na experimenty, kde je délka čtení méně důležitá, jako je resekvenování a transkriptomová analýza a nověji ChIP-Seq a methylační experimenty.[10] Čas přípravy vzorků DNA pro systémy SOLiD se stal mnohem rychlejším díky automatizaci příprav sekvenčních knihoven, jako je systém Tecan.[10]
Data barevného prostoru produkovaná platformou SOLiD lze dekódovat do DNA základen pro další analýzu, avšak software, který zohledňuje původní informace o barevném prostoru, může poskytnout přesnější výsledky. Life Technologies vydala BioScope,[26] balíček analýzy dat pro resekvenování, ChiP-Seq a transkriptomovou analýzu. Využívá algoritmus MaxMapper k mapování přečtených barevných prostorů.
Beckman Coulter
Beckman Coulter (Nyní Danaher ) dříve vyráběl řetězové zakončení a kapilární elektroforézu na DNA sekvencery pod názvem modelu CEQ, včetně CEQ 8000. Společnost nyní vyrábí GeXP Genetic Analysis System, který používá sekvenování terminátoru barviva. Tato metoda používá a termocykler stejným způsobem jako PCR denaturovat, anelovat a prodloužit fragmenty DNA, amplifikovat sekvenované fragmenty.[27][28]
Pacific Biosciences
Pacific Biosciences vyrábí sekvenční systémy PacBio RS a Sequel pomocí a sekvenování jedné molekuly v reálném čase nebo SMRT metoda.[29] Tento systém může produkovat čtecí délky několika tisíc párů bází. Vyšší chyby hrubého čtení jsou opraveny buď kruhovým konsensem - kde se stejné vlákno čte znovu a znovu - nebo pomocí optimalizovaného shromáždění strategií.[30] Vědci u těchto strategií uváděli přesnost 99,9999%.[31] Systém Sequel byl spuštěn v roce 2015 se zvýšenou kapacitou a nižší cenou.[32][33]

Oxford Nanopore
![]() | Tato část musí být aktualizováno. Důvod je uveden: Přesnost sekvenování Oxford Nanopore se od počátečního vydání jejich řadičů postupně zlepšuje a od roku 2020 níže uvedený odstavec nepřesně popisuje přesnost; PromethION je již roky komerčně dostupný. (Srpna 2020) |
Oxford Nanopore Technologies začala dodávat své první verze nanopore sekvenování Sekvencer MINION do vybraných laboratoří. Zařízení je dlouhé čtyři palce a napájí se z něj USB port. MinION dekóduje DNA přímo, když je molekula čerpána rychlostí 450 bází za sekundu prostřednictvím a nanopore suspendován v membráně. Změny elektrického proudu indikují přítomnou základnu. Je přesný na 60 až 85 procent, ve srovnání s 99,9 procenty u konvenčních strojů. Dokonce i nepřesné výsledky se mohou ukázat jako užitečné, protože produkují dlouhé délky čtení. GridION je o něco větší řadič, který zpracovává až pět průtokových buněk MinION najednou. PromethION je další (nevydaný) produkt, který bude používat paralelně až 100 000 pórů, což je vhodnější pro sekvenování velkého objemu.[35]
Srovnání
Aktuální nabídka technologie sekvenování DNA ukázat dominantního hráče: Illumina (Prosinec 2019), následovaný PacBio, MGI / BGI a Oxford Nanopore.
Sekvencer | Ion Torrent PGM [5][37][38] | 454 GS FLX [10] | HiSeq 2000 [5][10] | SOLiDv4 [10] | PacBio [5][39] | Sanger 3730xl [10] |
---|---|---|---|---|---|---|
Výrobce | Ion Torrent (Life Technologies) | 454 věd o životě (Roche) | Illumina | Applied Biosystems (Life Technologies) | Pacific Biosciences | Applied Biosystems (Life Technologies) |
Chemie sekvenování | Sekvenování iontových polovodičů | Pyrosekvenování | Sekvenční syntéza na bázi polymerázy | Sekvenování založené na ligaci | Fosfolinkové fluorescenční nukleotidy | Dideoxy ukončení řetězce |
Zesilovací přístup | Emulzní PCR | Emulzní PCR | Zesílení můstku | Emulzní PCR | Jedna molekula; žádné zesílení | PCR |
Výstup dat za běh | 100-200 Mb | 0,7 GB | 600 GB | 120 GB | 0,5 - 1,0 GB | 1,9–84 kB |
Přesnost | 99% | 99.9% | 99.9% | 99.94% | 88,0% (> 99,9999% CCS nebo HGAP) | 99.999% |
Čas na běh | 2 hodiny | 24 hodin | 3–10 dní | 7–14 dní | 2–4 hodiny | 20 minut - 3 hodiny |
Délka čtení | 200–400 bp | 700 bp | Spárovaný konec 100 x 100 bp | Spárovaný konec 50x50 bp | 14 000 bp (N50 ) | 400–900 bp |
Cena za běh | 350 USD | 7 000 USD | 6 000 $ (30x lidský genom) | 4 000 USD | 125–300 USD | 4 USD (jednorázové čtení / reakce) |
Cena za Mb | 1,00 $ | 10 USD | 0,07 USD | 0,13 USD | 0,13 $ - 0,60 $ USD | 2400 USD |
Cena za nástroj | 80 000 USD | 500 000 USD | 690 000 USD | 495 000 USD | 695 000 USD | 95 000 USD |
Reference
- ^ Cook-Deegan, Robert Mullan (1991). „Počátky projektu lidského genomu“. FASEB Journal. University of Washington. 5 (1): 8–11. doi:10.1096 / fasebj.5.1.1991595. PMID 1991595. S2CID 37792736. Citováno 20. října 2014.
- ^ A b C Metzker, M. L. (2005). „Rozvíjející se technologie v sekvenování DNA“. Genome Res. 15 (12): 1767–1776. doi:10,1101 / gr. 3770505. PMID 16339375.
- ^ A b Hutchison, C. A. III. (2007). „Sekvenování DNA: lavička u postele i mimo ni“. Nucleic Acids Res. 35 (18): 6227–6237. doi:10.1093 / nar / gkm 688. PMC 2094077. PMID 17855400.
- ^ A b F. S. Collins; M. Morgan; A. Patrinos (2003). „Projekt lidského genomu: lekce z rozsáhlé biologie“. Věda. 300 (5617): 286–290. Bibcode:2003Sci ... 300..286C. doi:10.1126 / science.1084564. PMID 12690187. S2CID 22423746.
- ^ A b C d Michael A Quail, Miriam Smith, Paul Coupland, Thomas D Otto, Simon R Harris, Thomas R Connor, Anna Bertoni, Harold P Swerdlow a Yong Gu (2012) Příběh tří sekvenčních platforem nové generace: srovnání sekvencerů Ion Torrent, Pacific Biosciences a Illumina MiSeq. BMC Genomics.
- ^ Michael A. Quail; Iwanka Kozarewa; Frances Smith; Aylwyn Scally; Philip J. Stephens; Richard Durbin; Harold Swerdlow; Daniel J. Turner (2008). „Vylepšení střediska genomu pro systém sekvencování Illumina“. Nat metody. 5 (12): 1005–1010. doi:10.1038 / nmeth.1270. PMC 2610436. PMID 19034268.
- ^ Heng Li, Jue Ruan a Richard Durbin (2008) http://genome.cshlp.org/content/18/11/1851 Mapování krátkých sekvencí DNA čtení a volání variant pomocí mapování skóre kvality. Výzkum genomu.
- ^ Gilbert W, Maxam A (1973). „Nukleotidová sekvence lac operátora“. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (12): 13581–3584. Bibcode:1973PNAS ... 70,3581G. doi:10.1073 / pnas.70.12.3581. PMC 427284. PMID 4587255.
- ^ Sanger F, Coulson AR (květen 1975). "Rychlá metoda pro stanovení sekvencí v DNA aktivovanou syntézou s DNA polymerázou". J. Mol. Biol. 94 (3): 441–8. doi:10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID 1100841.
- ^ A b C d E F G h i j k Lin Liu; Yinhu Li; Siliang Li; Ni Hu; Yimin He; Ray Pong; Danni Lin; Lihua Lu; Maggie Law (2012). „Srovnání sekvenčních systémů nové generace“. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012: 251364. doi:10.1155/2012/251364. PMC 3398667. PMID 22829749.
- ^ „Products: 454 Life Sciences, a Roche Company“. Archivovány od originál dne 2012-09-13. Citováno 2012-09-05.
- ^ „Produkty - Systém GS FLX +: 454 Life Sciences, společnost Roche“. Archivovány od originál dne 2012-09-05. Citováno 2012-09-05.
- ^ „Produkty - GS Junior System: 454 Life Sciences, společnost Roche“. Archivovány od originál dne 2012-09-13. Citováno 2012-09-05.
- ^ Mardis, Elaine R. (1. září 2008). "Metody sekvenování DNA nové generace". Roční přehled genomiky a lidské genetiky. 9 (1): 387–402. doi:10.1146 / annurev.genom. 09.081307.164359. PMID 18576944. S2CID 2484571.
- ^ http://www.genomeweb.com/sequencing/roche-shutting-down-454-sequencing-business Společnost Roche ukončuje podnikání se sekvenováním 454
- ^ http://www.bio-itworld.com/2013/4/23/roche-shuts-down-third-generation-ngs-research-programs.html Společnost Roche ukončuje výzkumné programy NGS třetí generace
- ^ A b C d „Produkty - analytický software: 454 Life Science, společnost Roche“. Archivovány od originál dne 19. 2. 2009. Citováno 2013-10-23.
- ^ Softwarová příručka k systému Genome Sequencer FLX, verze 2.3
- ^ Pokrok společnosti Solexa spočívá v genech - Businessweek
- ^ Systémy Illumina
- ^ Pevný
- ^ Sekvenování podle Sangera Life Technologies
- ^ http://www.thermofisher.com/iontorrent Ion Torrent
- ^ „Genetický analyzátor Applied Biosystems SeqStudio - USA“.
- ^ Přesnost systému SOLiD
- ^ Software SOLiD BioScope | Life Technologies
- ^ Rai, Alex J .; Kamath, Rashmi M .; Gerald, William; Fleisher, Martin (29. října 2008). „Analytická validace analyzátoru GeXP a návrh pracovního postupu pro objevování biomarkerů rakoviny pomocí multiplexovaného profilování genové exprese“. Analytická a bioanalytická chemie. 393 (5): 1505–1511. doi:10.1007 / s00216-008-2436-7. PMID 18958454. S2CID 46721686.
- ^ Beckman Coulter, Inc - GenomeLab GeXP Genetic Analysis System
- ^ Pacific Biosciences: PacBio Systems
- ^ Koren, S; Schatz, MC; Walenz, BP; Martin, J; Howard, JT; Ganapathy, G; Wang, Z; Rasko, DA; McCombie, WR; Jarvis, ED; Phillippy, AM (1. července 2012). „Čte se hybridní korekce chyb a de novo sestavení sekvenování jedné molekuly“. Přírodní biotechnologie. 30 (7): 693–700. doi:10,1038 / nbt.2280. PMC 3707490. PMID 22750884.
- ^ Chin, Chen-Shan; Alexander, David H .; Marks, Patrick; Klammer, Aaron A .; Drake, James; Heiner, Cheryl; Clum, Alicia; Copeland, Alex; Huddleston, John; Eichler, Evan E .; Turner, Stephen W .; Korlach, Jonas (2013). „Nehybridní, hotové sestavy mikrobiálního genomu z dlouho čtených dat sekvenování SMRT“. Přírodní metody. 10 (6): 563–569. doi:10.1038 / nmeth.2474. PMID 23644548. S2CID 205421576.
- ^ „Svět bio-IT“.
- ^ „PacBio uvádí na trh vysokovýkonný a levný systém sekvenování jedné molekuly“.
- ^ Gaskill, Melissa (29. srpna 2016). „První sekvenování DNA ve vesmíru, herní měnič“. NASA. Citováno 26. říjen 2016.
- ^ Regalado, Antonio (17. září 2014). „Radikální nový sekvencer DNA se konečně dostane do rukou vědců“. Recenze technologie. Citováno 3. října 2014.
- ^ Shendure, J .; Ji, H. (2008). "Sekvenování DNA nové generace". Nat. Biotechnol. 26 (10): 1135–1145. doi:10.1038 / nbt1486. PMID 18846087. S2CID 6384349.
- ^ Karow, J. (2010) Ion Torrent Systems představuje elektronický sekvencer 50 000 $ na AGBT. V pořadí.
- ^ „Ion PGM - Ion Torrent“. Archivovány od originál dne 2012-09-20. Citováno 2013-02-13.
- ^ Pacific Biosciences