Solidní sekvenování ABI - ABI Solid Sequencing
tento článek potřebuje další citace pro ověření.Leden 2010) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) ( |
Pevný (Sekvenování ligací a detekcí oligonukleotidů) je a sekvenování DNA nové generace technologie vyvinutá společností Life Technologies a je komerčně dostupný od roku 2006. Tato technologie nové generace generuje 108 - 109 malá sekvence se čte najednou. Využívá to 2 základní kódování dekódovat nezpracovaná data generovaná sekvenční platformou do sekvenčních dat.
Tuto metodu nelze zaměňovat s „sekvenováním syntézou“, což je princip používaný Roche-454 pyrosekvenování (představen v roce 2005, generuje miliony čtení 200–400 bp v roce 2009) a Solexa systém (nyní ve vlastnictví společnosti Illumina) (představený v roce 2006, generující stovky milionů čtení 50–100 bp v roce 2009)
Tyto metody snížily náklady z 0,01 USD / základnu v roce 2004 na téměř 0,0001 USD / základnu v roce 2006 a zvýšily kapacitu sekvenování z 1 000 000 základen / stroj / den v roce 2004 na více než 5 000 000 000 základen / stroj / den v roce 2009. Existuje více než 30 publikací popisujících jeho použití nejprve pro určování polohy nukleosomů od Valouev et al.,[1] transkripční profilování nebo RNA-Seq citlivé na řetězec s Cloonanem a kol.,[2] transkripční profilování jedné buňky s Tangem a kol.[3] a nakonec lidské resekvenování s McKernanem a kol.[4]
O metodě používané tímto strojem (sekvenování podle ligace) se uvádí, že má určité problémy se sekvenováním palindromických sekvencí.[5]
Chemie
Ze vzorku, který má být sekvenován, se připraví knihovna fragmentů DNA a použije se k přípravě populací klonálních kuliček. To znamená, že na povrchu každé magnetické kuličky bude přítomen pouze jeden druh fragmentu. Fragmenty připojené k magnetickým kuličkám budou mít připojenou sekvenci univerzálního P1 adaptéru, takže počáteční sekvence každého fragmentu je známá i identická. Emulze PCR probíhá v mikroreaktorech obsahujících všechna nezbytná činidla pro PCR. Výsledné produkty PCR připojené k perličkám jsou poté kovalentně navázány na skleněné sklíčko.
Primery hybridizují na sekvenci adaptéru P1 v šabloně knihovny. Sada čtyř fluorescenčně značených dibázových sond soutěží o ligaci na sekvenční primer. Specifičnost di-bazické sondy se dosahuje dotazováním každé 1. a 2. báze v každé ligační reakci. Provádí se několik cyklů ligace, detekce a štěpení s počtem cyklů určujících konečnou délku čtení. Po sérii ligačních cyklů je produkt extenze odstraněn a šablona je resetována primerem komplementárním k poloze n-1 pro druhé kolo ligačních cyklů.
U každé značky sekvence je dokončeno pět kol resetování primeru. Prostřednictvím procesu resetování primerů je každá báze vyšetřována ve dvou nezávislých ligačních reakcích dvěma různými primery. Například báze v poloze pro čtení 5 se testuje primerem číslo 2 v ligačním cyklu 2 a primerem číslo 3 v ligačním cyklu 1.
Propustnost a přesnost
Podle ABI platforma SOLiD 3plus poskytuje 60 gigabází použitelných dat DNA za běh. Díky dvěma základním kódovacím systémům je do technologie zabudována vlastní kontrola přesnosti a nabízí přesnost 99,94%. Chemie systémů také znamená, že mu nebrání homopolymery na rozdíl od systému Roche 454 FLX a tak velké a obtížné oblasti opakování homopolymeru již nejsou problémem sekvence.
Aplikace
Přirozeně bude tato technologie použita k sekvenování DNA, ale vzhledem k vysoké paralelní povaze všech technologií nové generace mají také aplikace transkriptomika a epigenomika.
Microarrays byla kdysi základem transkriptomiky posledních deseti let a technologie založená na poli se následně rozvětvila do dalších oblastí. Jsou však omezené v tom, že lze získat pouze informace pro sondy, které jsou na čipu. Lze získat pouze informace o organismech, pro které jsou čipy k dispozici, a přicházejí se všemi problémy hybridizace velkého počtu molekul (různé hybridizační teploty). Transkriptomika RNA-Seq podle dalšího genového sekvenování bude znamenat, že tyto bariéry již neplatí. Celý transkriptom jakéhokoli organismu by mohl být potenciálně sekvenován v jednom běhu (pro velmi malé bakteriální genomy) a nejenže by byla k dispozici identifikace každého transkriptu, ale je možné i profilování exprese, protože lze dosáhnout i kvantitativních čtení.
Chromatinová imunoprecipitace (ChIP) je metoda pro stanovení vazebných míst transkripčního faktoru a interakcí DNA-protein. V minulosti byl s určitým úspěchem kombinován s technologií pole (čip ChIP). V této oblasti lze také použít sekvenování dalšího genu. Může být také provedena methylační imunoprecipitace (MeDIP) a také na polích.
Schopnost dozvědět se více o methylaci a vazebných místech pro TF v širokém měřítku genomu je cenným zdrojem a mohla by nás naučit hodně o nemoci a molekulární biologii obecně.
Viz také
- 2 Základní kódování
- Sekvenování nové generace
- Applied Biosystems
- Illumina (společnost)
- 454 biologických věd
Reference
- ^ Valouev A, Ichikawa J, Tonthat T a kol. (Červenec 2008). „Mapa polohy nukleosomů s vysokým rozlišením C. elegans odhaluje nedostatek univerzálního sekvenčně diktovaného umístění“. Výzkum genomu. 18 (7): 1051–63. doi:10.1101 / gr.076463.108. PMC 2493394. PMID 18477713.
- ^ Cloonan N, Forrest AR, Kolle G a kol. (Červenec 2008). "Profilování transkriptomů kmenových buněk pomocí masivního sekvenování mRNA". Přírodní metody. 5 (7): 613–9. doi:10.1038 / nmeth.1223. PMID 18516046.
- ^ Tang F, Barbacioru C, Wang Y a kol. (Květen 2009). msgstr "Analýza celého transkriptomu mRNA-Seq jedné buňky". Přírodní metody. 6 (5): 377–82. doi:10.1038 / nmeth.1315. PMID 19349980.
- ^ McKernan KJ, Peckham HE, Costa GL a kol. (Září 2009). „Sekvence a strukturní variace v lidském genomu odhalené krátce čteným, masivně paralelním ligačním sekvenováním pomocí kódování dvou bází“. Výzkum genomu. 19 (9): 1527–41. doi:10.1101 / gr.091868.109. PMC 2752135. PMID 19546169.
- ^ Yu-Feng Huang; Sheng-Chung Chen; Yih-Shien Chiang & Tzu-Han Chen (2012). „Palindromická sekvence brání mechanismu sekvenování ligací“. Biologie systémů BMC. 6 Suppl 2: S10. doi:10.1186 / 1752-0509-6-S2-S10. PMC 3521181. PMID 23281822.
Další čtení
- Mardis ER (2008). "Metody sekvenování DNA nové generace". Roční přehled genomiky a lidské genetiky. 9: 387–402. doi:10.1146 / annurev.genom. 09.081307.164359. PMID 18576944.
- Mardis ER (2009). „Nové strategie a vznikající technologie pro masivně paralelní řazení: aplikace v lékařském výzkumu“. Genomová medicína. 1 (4): 40. doi:10,1186 / gm40. PMC 2684661. PMID 19435481.