Bezbuněčné proteinové pole - Cell-free protein array

Bezbuněčné proteinové pole technologie vyrábí proteinové mikročipy provedením in vitro syntéza cílových proteinů z jejich DNA šablony. Tato metoda syntézy proteinových mikročipů překonává mnoho překážek a výzev, kterým čelí tradiční metody produkce proteinového pole[1] které zabránily širokému přijetí proteinových mikročipů v proteomika. K testování lze použít proteinová pole vyrobená z této technologie interakce protein-protein, jakož i proteinové interakce s jinými buněčnými molekulami, jako je DNA a lipidy. Mezi další aplikace patří testy enzymatické inhibice a screening specificity protilátek.

Přehled / pozadí

Útěk z úspěchu DNA mikročipy vyvolalo velké nadšení pro proteinové mikročipy. Bílkovinné mikročipy se však zcela nerozběhly podle očekávání, a to ani při použití nezbytných nástrojů a know-how z mikročipů DNA, které jsou připraveny k adaptaci. Jedním z hlavních důvodů je to, že proteinové mikročipy jsou mnohem pracnější a technicky náročnější na konstrukci než DNA mikročipy.

Tradiční metody výroby proteinových polí vyžadují samostatné in vivo exprese stovek nebo tisíců proteinů, následovaná samostatnou purifikací a imobilizací proteinů na pevném povrchu. Technologie bezbuněčných proteinových polí se pokouší zjednodušit konstrukci proteinových mikročipů tím, že obejde potřebu exprese proteinů bakterie buňky a následná potřeba je očistit. Využívá výhody dostupného bezbuněčná syntéza bílkovin technologie, která prokázala, že syntéza bílkovin může probíhat bez neporušené buňky, pokud jde o buněčné extrakty obsahující templát DNA, transkripce a překlad suroviny a stroje jsou poskytovány.[2] Mezi běžné zdroje buněčných extraktů používaných v technologii bezbuněčných proteinových polí patří pšeničné klíčky, Escherichia coli a králík retikulocyty. Buněčné výtažky z jiných zdrojů, jako např hypertermofily, hybridomy, Xenopus oocyty byly také použity buňky hmyzu, savců a lidí.[3]

Cílové proteiny jsou syntetizovány in situ na proteinové microarray, přímo z šablony DNA, čímž se přeskočí mnoho kroků v tradiční produkci proteinové microarray a jejich doprovodná technická omezení. Ještě důležitější je, že exprese proteinů může být provedena paralelně, což znamená, že všechny proteiny mohou být exprimovány společně v jedné reakci. Tato schopnost multiplexovat expresi proteinů je významným šetřičem času ve výrobním procesu.

Metody syntézy

In situ metody

V in situ způsobem se syntéza proteinů provádí na povrchu proteinového pole, který je předem potažen reagentem zachycujícím protein nebo protilátka. Jakmile se nově syntetizované proteiny uvolní z ribozom, sekvence značek který je také syntetizován na N- nebo C-konec každého rodícího se proteinu bude vázáno záchytným činidlem nebo protilátkou, čímž dojde k imobilizaci proteinů za vzniku řady. Mezi běžně používané značky patří polyhistidin (Jeho) 6 a glutathion s-transferáza (GST).

Různé výzkumné skupiny vyvinuly své vlastní metody, každá se liší svým přístupem, ale lze je shrnout do 3 hlavních skupin.

Schéma NAPPA

Programovatelné proteinové pole nukleových kyselin (NAPPA)

NAPPA[4] používá DNA templát, který již byl imobilizován na stejném povrchu pro zachycení proteinu. Šablona DNA je biotinylovaný a je vázán avidin který je předem potažen na povrch zachycení proteinu. Nově syntetizované proteiny, které jsou označeny GST, jsou poté imobilizovány vedle templátové DNA navázáním na sousední polyklonální anti-GST záchytnou protilátku, která je také předem potažena na záchytný povrch. Hlavní nevýhodou této metody jsou mimořádně zdlouhavé přípravné kroky na začátku procesu: (1) klonování z cDNA připraven na výraz vektor; a (2) nutnost biotinylovat plazmid DNA, ale neinterferovat s transkripcí. Výsledné proteinové pole navíc není „čisté“, protože proteiny jsou lokalizovány společně s jejich templáty DNA a zachycují protilátky.[3]

Schéma PISA

Protein in situ pole (PISA)

Na rozdíl od NAPPA, PISA[5] úplně obchází imobilizaci DNA, protože se templát DNA přidá jako volná molekula do reakční směsi. V roce 2006 další skupina rafinovala a miniaturizovala tuto metodu pomocí techniky vícenásobného špinění, aby našla templát DNA a bezbuněčnou transkripční a translační směs na proteinové mikročipu s vysokou hustotou až 13 000 skvrn.[6] To bylo možné díky automatizovanému systému použitému k přesnému a postupnému dodávání reagencií pro transkripční / translační reakci, která probíhá v malé, nananolitové kapičce.

Schéma In situ zachycení puromycinu

In situ zachycení puromycinu

Tato metoda je adaptací Zobrazení mRNA technologie. PCR DNA je nejprve přepsána mRNA a jednořetězcovou DNA oligonukleotid upraveno pomocí biotin a puromycin na každém konci je pak hybridizován na 3'-konec mRNA. MRNA se poté uspořádají na podložní sklíčko a imobilizují se vazbou biotinu na streptavidin který je předem potažen na sklíčku. Buněčný extrakt se poté nanese na sklíčko po dobu in situ překlad se uskuteční. Když ribosom dosáhne hybridizovaného oligonukleotidu, zastaví a začlení molekulu puromycinu do rodícího se polypeptid řetěz, čímž se připojuje nově syntetizovaný protein k mikročipu prostřednictvím DNA oligonukleotidu.[7] Po štěpení mRNA se získá čisté proteinové pole RNáza. Proteinové skvrny generované touto metodou jsou velmi ostře definované a lze je produkovat při vysoké hustotě.

Nano-well array format

Obrázek 4: Schematický diagram formátu pole nano jamek

Formáty polí nanowell se používají k expresi jednotlivých proteinů v maloobjemových reakčních nádobách nebo nanočásticích[8][9] (Obrázek 4). Tento formát je někdy upřednostňován, protože vylučuje potřebu imobilizovat cílový protein, což by mohlo vést k potenciální ztrátě aktivity proteinu. Miniaturizace pole také šetří roztok a vzácné sloučeniny, které by mohly být použity při screeningových testech. Kromě toho strukturní vlastnosti jednotlivých jamek pomáhají předcházet křížové kontaminaci mezi komorami. V roce 2012 byla zveřejněna vylepšená NAPPA, která k zabránění difúze používala pole nanočástic. Zde byla DNA imobilizována v jamce společně s anti-GST protilátkou. Poté byla přidána bezbuněčná expresní směs a jamky byly uzavřeny víčkem. Vznikající proteiny obsahující GST-tag byly navázány na povrch jamky, což umožnilo NAPPA-array s vyšší hustotou a téměř bez křížové kontaminace.[10]

Pole DNA na proteinové pole (DAPA)

Obrázek 5: Schematický diagram DAPA

DNA array to protein array (DAPA) je metoda vyvinutá v roce 2007 k opakované produkci proteinových polí jejich „tiskem“ z jednoho pole šablony DNA na vyžádání[11] (Obrázek 5). Začíná to špinením a imobilizací řady šablon DNA na skleněném sklíčku. Sklíčko se poté sestaví tváří v tvář druhému sklíčku předem potaženému činidlem zachycujícím protein a mezi dva sklíčka se umístí membrána nasáklá buněčným extraktem, aby proběhla transkripce a translace. Nově syntetizované proteiny značené his jsou poté imobilizovány na podložní sklíčko za vzniku pole. V publikaci v 18 z 20 replikací bylo možné vygenerovat kopii proteinové mikročipy. Proces lze potenciálně opakovat tak často, jak je potřeba, pokud DNA není poškozena DNAses, degradací nebo mechanickým oděrem.

Výhody

Mnoho výhod technologie bezbuněčného proteinového pole řeší omezení buněčného expresního systému používaného v tradičních metodách produkce proteinové microarray.

Rychlé a nákladově efektivní

Metoda se vyhýbá klonování DNA (s výjimkou NAPPA) a může rychle převést genetickou informaci na funkční proteiny pomocí PCR DNA. Snížené výrobní kroky a schopnost miniaturizovat systém šetří spotřebu činidla a snižuje výrobní náklady.

Zlepšuje dostupnost bílkovin

Mnoho proteinů, včetně protilátek, je obtížné exprimovat v hostitelských buňkách kvůli problémům s nerozpustností, disulfid toxicita vazeb nebo hostitelských buněk.[1] Bezbuněčné proteinové pole zpřístupňuje mnoho z těchto proteinů pro použití v proteinových mikročipech.

Umožňuje dlouhodobé ukládání

Na rozdíl od DNA, která je vysoce stabilní molekulou, jsou proteiny heterogenní třídou molekul s odlišnou stabilitou a fyziochemickými vlastnostmi. Udržování skládání a funkce proteinů v imobilizovaném stavu po dlouhou dobu skladování je hlavní výzvou pro proteinové čipy. Bezbuněčné metody poskytují možnost rychlého získání proteinových mikročipů na vyžádání, čímž se eliminují jakékoli problémy spojené s dlouhodobým skladováním.

Flexibilní

Metoda je přístupná řadě různých templátů: produkty PCR, plazmidy a mRNA. Během syntézy mohou být zahrnuty další složky k úpravě prostředí pro skládání proteinu, tvorbu disulfidové vazby, modifikaci nebo aktivitu proteinu.[3]

Omezení

  • Posttranslační modifikace bílkovin v proteinech generovaných bezbuněčnou syntézou proteinů [12] je stále omezený ve srovnání s tradičními metodami,[13] a nemusí být tak biologicky relevantní.

Aplikace

Interakce s proteiny: Chcete-li vyhledat interakce protein-protein[4] a proteinové interakce s jinými molekulami, jako jsou metabolity, lipidy, DNA a malé molekuly .;[14] test inhibice enzymů:[8] pro vysoce výkonný screening kandidátů na léky a pro objevení nových enzymy pro použití v biotechnologie; skríning specificity protilátek.[15]

Reference

[16]

  1. ^ A b Stevens, R. C. (2000). „Návrh vysoce výkonných metod produkce proteinů pro strukturní biologii.“ Struktura 8 (9): R177-R185.
  2. ^ Katzen, F., G. Chang a kol. (2005). „Minulost, současnost a budoucnost bezbuněčné syntézy proteinů.“ Trendy Biotechnol 23 (3): 150–6.
  3. ^ A b C On, M., O. Stoevesandt a kol. (2008). „In situ syntéza proteinových polí.“ Curr Opin Biotechnol 19 (1): 4–9.
  4. ^ A b Ramachandran, N., E. Hainsworth a kol. (2004). „Samoobslužné proteinové mikropole.“ Science 305 (5680): 86–90.
  5. ^ On, M. a M. J. Taussig (2001). „Jednostupňové generování proteinových polí z DNA bezbuněčnou expresí a imobilizací in situ (metoda PISA).“ Nucleic Acids Res 29 (15): E73-3.
  6. ^ Angenendt, P., J. Kreutzberger a kol. (2006). „Generování proteinových mikročipů s vysokou hustotou pomocí bezbuněčné exprimace nepurifikovaných produktů PCR in situ.“ Mol Cell Proteomics 5 (9): 1658–1666.
  7. ^ Tao, S. C. a H. Zhu (2006). „Výroba proteinových čipů zachycením rodících se polypeptidů.“ Nat Biotechnol 24 (10): 1253–4.
  8. ^ A b Angenendt, P., L. Nyarsik a kol. (2004). "Bezbuněčná exprese proteinu a funkční test ve formátu čipu s nanočlánky." Anal Chem 76 (7): 1844–189.
  9. ^ Kinpara, T., R. Mizuno a kol. (2004). „Pole komory pikolitru pro bezbuněčnou syntézu proteinů.“ J Biochem 136 (2): 149–54.
  10. ^ Takulapalli BR, Qiu J a kol. (2012). „Pole nanosond s vysokou hustotou bez difúze.“ J Proteome Res. 11 (8): 4382-91
  11. ^ On, M., O. Stoevesandt a kol. (2008). „Tisk proteinových polí z polí DNA.“ Nat Methods 5 (2): 175–7.
  12. ^ Promega in vitro Průvodce výrazem Archivováno 7. Listopadu 2007 v Wayback Machine
  13. ^ Chatterjee, D.K. a J. LaBaer (2006). „Proteinové technologie.“ Curr Opin Biotech 17 (4): 334–336.
  14. ^ On, M. a M. W. Wang (2007). "Sestavování proteinů bezbuněčnou syntézou." Biomol Eng 24 (4): 375–80.
  15. ^ On, M. a M. J. Taussig (2003). „Technologie DiscernArray: bezbuněčná metoda pro generování proteinových polí z DNA DNA.“ J Immunol Methods 274 (1–2): 265–70.
  16. ^ [1].

externí odkazy