ŽEHNAT - BLESS

ŽEHNAT, také známý jako přestává označovat, obohacovat streptavidin a sekvenování nové generace, je metoda používaná k detekci genom - široký dvouvláknový Poškození DNA.[1] Na rozdíl od imunoprecipitace chromatinu (ChIP) metody identifikace Dvouřetězcové zlomy DNA (DSB) značením proteinů pro opravu DNA využívá BLESS biotinylovaný Linkery DNA k přímé značce genomové DNA in situ což umožňuje obohacení vzorků o vysokou specificitu streptavidin korálky a následné sekvenování mapování DSB na základě rozlišení nukleotidů.

Pracovní postup

Pracovní postup BLESS. 1) Dvouřetězcové DNA zlomy (DSB) jsou označeny in situ s proximálními vlásenkovými linkery DNA obsahujícími biotinový marker. 2) Buňky jsou fixovány, lyžovány a ošetřeny proteinázami pro extrakci a následné stříhání genomové DNA (gDNA). 3) Značené a neznačené fragmenty gDNA procházejí kuličkami odvozenými od streptavidinu, které zachycují značené fragmenty s vysokou specificitou díky silné afinitě biotinových markerů k streptavidinu. 4) Po průchodu kuličkami streptavidinu jsou odstraněny neznačené gDNA fragmenty, přičemž zůstanou obohacené biotinem značené gDNA fragmenty. 5) Distální linker je ligován na značené fragmenty gDNA na volném konci. 6) I-Scel endonukleáza štěpí linkery v restrikčním místě, aby uvolnila gDNA fragmenty z biotinu. 7) Primery specifické pro čárový kód se používají pro amplifikaci obohacených fragmentů pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). 8) Sekvenování produktů PCR nové generace se poté použije pro analýzu rozlišení nukleotidů DSB v genomu.

Návrh biotinylovaného linkeru

Biotinylovaný linker je navržen tak, aby tvořil a struktura vlásenky který specificky označuje DSB a ne jednořetězcové zlomy DNA. Linker má tupý, ligatovatelný konec se známou sekvencí čárových kódů, která označuje místo ligace a také Xhol restrikční enzym rozpoznávací místo sousedící s čárovým kódem. Vlásenková smyčka linkeru je kovalentně navázána na molekulu biotinu, což umožňuje následné obohacení značené DNA o streptavidinové kuličky.[1]

Použití biotinových štítků umožňuje specifickou vazbu bez narušení DNA kvůli malé velikosti markeru. Protože biotin má také vysokou afinitu ke streptavidinu, lze na kuličkách streptavidinu provést další vysoce specifické čištění.[2]

Čištění jader a in situ Značení

Po indukci DSB jsou buňky fixovány formaldehydem, lyžovány a ošetřeny proteinázy očistit neporušená jádra.[1] Počáteční krok fixace se stabilizuje chromatin a zabraňuje tvorbě dalších DSB během přípravy vzorku.[3] DSB jsou poté otupeny a inkubovány s biotinylovanými linkery v přítomnosti T4 DNA ligáza. T4 ligáza nerozpoznává jednořetězcové zlomy a jako taková přímo označuje místa DSB prostřednictvím kovalentního připojení biotinylovaného linkeru.[1]

Extrakce, fragmentace a čištění DNA

Značená genomová DNA je extrahována z jader a fragmentována HaeIII restrikční enzym trávení a sonikace. Značené fragmenty DNA se poté čistí za použití kuliček získaných ze streptavidinu, proteinu vázajícího biotin v bakterii Streptomyces avidinii. Protože interakce streptavidinu a biotinu je silná a vysoce specifická, umožňuje čištění vzorku na kuličkách potažených streptavidinem silné obohacení značených fragmentů DNA.[1][2]

Značení a trávení DNA distálního linkeru

Druhý krok značení nastává po fragmentaci a afinitním čištění biotin-streptavidinu k připojení vazebných míst primeru k volnému konci zachycené DNA. Podobně jako v prvním kroku značení se T4 DNA ligáza používá k připojení distálního linkeru k neznačenému konci DNA. Distální linker má také Xhol restrikční enzym rozpoznávací místo, ale není kovalentně vázáno na molekulu biotinu. Jakmile je připojen distální linker, zachycené fragmenty DNA jsou štěpeny pomocí I-SceI endonukleázy které štěpí jak biotinylované linkery, tak distální linkery, aby uvolnily fragmenty DNA.[1]

Amplifikace a sekvenování PCR

Štěpené řetězce DNA se amplifikují pomocí PCR s primery komplementárními k sekvencím čárových kódů v biotinylovaném linkeru a distálním linkeru. Amplifikovaná DNA se dále zpracovává štěpením restrikčními enzymy Xhol za účelem odstranění konců I-Scel a před sekvenováním se čistí. Ačkoli použití sekvenování nové generace metody se doporučují pro analýzu BLESS, Sangerovo sekvenování Bylo také prokázáno, že generuje úspěšné, i když méně robustní výsledky.[1]

Výpočetní analýza

Čtení sekvencí BLESS lze analyzovat pomocí softwarové sady Instant Sequencing (iSeq).[1] K detekci stránek DSB jsou čtení zarovnána na a referenční genom použitím motýlek k určení pozic chromozomu. Genom je rozdělen na intervaly a hypergeometrické testy se používají k identifikaci intervalů obohacených o mapovaná čtení. DSB jsou identifikovány porovnáním obohacení v ošetřených vzorcích oproti kontrole. Statisticky významné zvýšení vzorku indukovaného poškozením DNA naznačuje, že DNA v tomto intervalu je křehká a obohacená o DSB.[4]

Výhody

  1. Použití biotinylovaných linkerů DNA určených ke specifickému rozpoznání dvouřetězcových zlomů DNA umožňuje méně zaujatý a přímější průzkum zlomeniny bez nutnosti spoléhat se na nativní a / nebo DSB-proxy proteiny, jako je například fosforylovaná histonová varianta H2A.X (γH2A.X), v buňce.[5] Z tohoto důvodu může být BLESS použit v různých buňkách z různých organismů.
  2. Ze stejného důvodu je BLESS také citlivý na více zdrojů dvouvláknových zlomů, jako je chemické a fyzické narušení DNA, zhasnutí replikační vidlice, stejně jako přítomnost telomer končí.[1] Díky tomu je BLESS vhodný pro analýzu buněk za různých podmínek.
  3. Dochází k označování DSB in situ, snížení rizika falešně pozitivních výsledků detekce zlomů DNA v důsledku mechanického stříhání a chemického zpracování vzorků.

Omezení

  1. Kvůli specifičnosti designu linkeru mohou biotinylované markery značit pouze dvouřetězcové zlomy DNA na otupit, ne soudržný končí, což vede k méně účinné ligaci.
  2. Ve srovnání s novějšími zlomyslný metody průzkumu, jako je BLISS, BLESS vyžaduje pro úspěšnou analýzu velké množství buněčného výchozího materiálu, což vede k zdlouhavé a časově náročné přípravě a zpracování vzorku. Pro zpracování 24 vzorků vyžaduje protokol BLESS 60 pracovních hodin v průběhu 15 dnů, zatímco BLISS vyžaduje 12 pracovních hodin v průběhu 5 dnů.[6]
  3. Protože buňky vyžadují před extrakcí DNA chemickou fixaci, BLESS je náchylný k vysokému šumu pozadí z artefaktů fixace. Ukázalo se však, že přísná vlastní optimalizace tento problém snižuje.[7]
  4. Kvůli nedostatku kontrol PCR není BLESS plně kvantitativní metodou a je náchylný k zkreslení amplifikace, což vede ke špatné škálovatelnosti.
  5. BLESS je vhodný pouze k detekci dvouvláknových zlomů v jednom konkrétním čase v genomu ve srovnání s kontinuální analýzou.

Alternativní metody

Přerušuje označování in situ a sekvenování (BLISS)
V BLISS jsou buňky nebo tkáňové řezy připojeny k a krycí sklo nejprve před označováním DSB. To některé umožňuje centrifugace kroky, které je třeba vynechat, čímž se sníží počet umělých DSB zavedených z přípravy vzorku a sníží se ztráta vzorku. Důležité je, že umožňuje použít mnohem menší množství výchozího materiálu ve srovnání s BLESS. Dalším vylepšením je použití in vitro transkripce generovat a zesilovat RNA sekvence pro příprava knihovny. BLISS používá Bakteriofág T7 zprostředkovaná transkripce spíše než PCR, což snižuje chyby způsobené zkreslením amplifikace PCR, ke kterým dochází u BLESS.[6]
Imobilizovaný-BLESS (i-BLESS)
Omezení původní metody BLESS spočívá v tom, že je problematická při aplikaci na menší buňky, jako je kvasinkové buňky. Zatímco nízké rychlosti centrifugace používané během izolace jader nejsou dostatečně účinné pro malé buňky, zvyšující se rychlosti centrifugace mohou genomovou DNA smykovat. V i-BLESS jsou však buňky imobilizovány agarózové korálky před označením DSB.[8] To umožňuje použití vyšších rychlostí centrifugace bez umělého stříhání DNA. Zbytek postupu značení DSB následuje po postupu BLESS a značené fragmenty DNA se získají z agarózových kuliček před krokem zachycení streptavidinu. Metoda i-BLESS se neomezuje pouze na kvasinky a lze ji teoreticky použít na všechny buňky.
DSBCapture
Podobně jako BLESS používá DSBCapture k označení DSB biotinylované adaptéry in situ a streptavidinové kuličky k izolaci značených fragmentů DNA pro amplifikaci a sekvenování.[9] Zatímco značení v BLESS spoléhá na tupou ligaci, DSBCapture používá efektivnější ligace se soudržným koncem připojit biotinylovaný modifikovaný Adaptéry Illumina. Kromě toho se DSBCapture ve srovnání s BLESS spoléhá na méně kroků PCR, což snižuje zkreslení amplifikace.[10] Tato metoda také generuje knihovny s vyšší sekvenční diverzitou než BLESS, což eliminuje potřebu špičat v jiných knihovnách, aby se zlepšila diverzita před sekvenováním. Kromě toho používá DSBCapture sekvenování na jednom konci na rozdíl od BLESSu, kde sekvenování může začít z obou konců. Výsledky sekvenování na jednom konci odrážejí pouze sekvence míst DSB, což zlepšuje výtěžnost dat.[11]
GUIDE-Seq
GUIDE-Seq, také známý jako nestranná identifikace DSB v rámci celého genomu povolená sekvenováním, využívá začlenění dvouřetězcový oligodeoxynukleotid (dsODN) sekvence k označení míst DSB v živých buňkách.[12] Umožňuje značení DSB po delší dobu a místa poškození DNA identifikovaná pomocí GUIDE-Seq odrážejí nahromaděné DSB. Naproti tomu BLESS pouze označuje a detekuje přechodné DSB, které existují, když byly buňky fixovány.

Aplikace

Zatímco dvouvláknové zlomy v DNA mohou být způsobeny různými zdroji narušení, často jsou během nich pozorovány s vysokou frekvencí apoptóza a může přispívat k nestabilitě genomu, což vede k onkogenním mutacím.[1][13] Z tohoto důvodu jsou pro zlomové průzkumy užitečné specifické metody mapování DSB s vysokým rozlišením, jako je BLESS.

DSB mohou být uměle indukovány pomocí editace genomu technologie jako CRISPR-Cas9 nebo TALEN. Tyto technologie mohou vést k neúmyslným modifikacím DNA na mimo cílových místech genomu.[14] Vzhledem k tomu, že BLESS může identifikovat nukleotidovou pozici DSB, lze ji použít k určení, zda editace mimo cíl genomu došlo k umístění DSB neúmyslně zavedenému těmito nukleázovými systémy.[7]

Reference

  1. ^ A b C d E F G h i j Crosetto N, Mitra A, Silva MJ, Bienko M, Dojer N, Wang Q, Karaca E, Chiarle R, Skrzypczak M, Ginalski K, Pasero P, Rowicka M, Dikic I (duben 2013). „Mapování dvouřetězcových zlomů DNA s nukleotidovým rozlišením sekvenováním příští generace“. Přírodní metody. 10 (4): 361–5. doi:10.1038 / nmeth.2408. PMC  3651036. PMID  23503052.
  2. ^ A b „Interakce avidin-biotin - CA“. www.thermofisher.com. Citováno 2019-03-01.
  3. ^ Kozubek S, Lukásová E, Amrichová J, Kozubek M, Lisková A, Slotová J (červen 2000). "Vliv fixace buněk na topografii chromatinu". Analytická biochemie. 282 (1): 29–38. doi:10,1006 / abio.2000,4538. PMID  10860496.
  4. ^ „BLESS: Mapujte genomové DNA dvouřetězcové zlomy pomocí sekvenování nové generace“. breakome.utmb.edu. Citováno 2019-03-01.
  5. ^ Sharma A, Singh K, Almasan A (2012). Fosforylace histonu H2AX: marker poškození DNA. Metody v molekulární biologii. 920. s. 613–26. doi:10.1007/978-1-61779-998-3_40. ISBN  978-1-61779-997-6. PMID  22941631.
  6. ^ A b Yan WX, Mirzazadeh R, Garnerone S, Scott D, Schneider MW, Kallas T, Custodio J, Wernersson E, Li Y, Gao L, Federova Y, Zetsche B, Zhang F, Bienko M, Crosetto N (květen 2017). „BLISS je univerzální a kvantitativní metoda pro genomové profilování dvouřetězcových zlomů DNA“. Příroda komunikace. 8: 15058. doi:10.1038 / ncomms15058. PMC  5437291. PMID  28497783.
  7. ^ A b Bouwman BA, Crosetto N (prosinec 2018). „Endogenní DNA dvojité vlákno se zlomí během DNA transakcí: vznikající poznatky a metody pro profilování v celém genomu“. Geny. 9 (12): 632. doi:10,3390 / geny9120632. PMC  6316733. PMID  30558210.
  8. ^ Biernacka A, Zhu Y, Skrzypczak M, Forey R, Pardo B, Grzelak M, Nde J, Mitra A, Kudlicki A, Crosetto N, Pasero P, Rowicka M, Ginalski K (2018). „i-BLESS je ultra citlivá metoda pro detekci dvouřetězcových zlomů DNA“. Komunikační biologie. 1 (1): 181. doi:10.1038 / s42003-018-0165-9. PMC  6208412. PMID  30393778.
  9. ^ Lensing SV, Marsico G, Hänsel-Hertsch R, Lam EY, Tannahill D, Balasubramanian S (říjen 2016). „DSBCapture: zachytávání in situ a sekvenování zlomů DNA“. Přírodní metody. 13 (10): 855–7. doi:10.1038 / nmeth.3960. PMC  5045719. PMID  27525976.
  10. ^ Aird D, Ross MG, Chen WS, Danielsson M, Fennell T, Russ C, Jaffe DB, Nusbaum C, Gnirke A (2011). „Analýza a minimalizace předpětí amplifikace PCR v sekvenčních knihovnách Illumina“. Genome Biology. 12 (2): R18. doi:10.1186 / gb-2011-12-2-r18. PMC  3188800. PMID  21338519.
  11. ^ Mitra A, Skrzypczak M, Ginalski K, Rowicka M (2015). „Strategie pro dosažení vysoké přesnosti sekvenování vzorků s nízkou rozmanitostí a zabránění krvácení vzorků pomocí platformy ilumina“. PLOS One. 10 (4): e0120520. doi:10.1371 / journal.pone.0120520. PMC  4393298. PMID  25860802.
  12. ^ Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, Thapar V, Wyvekens N, Khayter C, Iafrate AJ, Le LP, Aryee MJ, Joung JK (únor 2015). „GUIDE-seq umožňuje genomové profilování štěpení mimo cíl nukleázami CRISPR-Cas“. Přírodní biotechnologie. 33 (2): 187–197. doi:10.1038 / nbt.3117. PMC  4320685. PMID  25513782.
  13. ^ Aparicio T, Baer R, Gautier J (červenec 2014). „Výběr cesty opravy dvouvláknového zlomu DNA a rakovina“. Oprava DNA. 19: 169–75. doi:10.1016 / j.dnarep.2014.03.014. PMC  4051845. PMID  24746645.
  14. ^ Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD (září 2013). „Vysokofrekvenční mimotelová mutageneze vyvolaná nukleázami CRISPR-Cas v lidských buňkách“. Přírodní biotechnologie. 31 (9): 822–6. doi:10,1038 / nbt.2623. PMC  3773023. PMID  23792628.

externí odkazy