Secretomics - Secretomics

Secretomics je typ proteomika což zahrnuje analýzu sekretářka —Všechny vylučované proteiny buňky, tkáně nebo organismu.[1] Vylučované proteiny se účastní různých fyziologických procesů, včetně buněčná signalizace a matice předělávání, ale jsou také nedílnou součástí invaze a metastáza z maligní buňky.[2] Sekretomika byla tedy zvláště důležitá při objevu biomarkery pro rakovina[3] a porozumění molekulárním základům patogeneze.[4][5] Analýza nerozpustného podílu sekretomu ( extracelulární matrix ) byl nazván matrisomics.[6]

Historie sekretomatu

V roce 2000 Tjalsma et al. ve své studii eubacterium vytvořili termín „secretome“ B. subtilis. Definovali sekretom jako všechny vylučované proteiny a sekreční aparát bakterií. Využití databáze proteinových sekvencí v B. subtilis a algoritmus, který sledoval místa štěpení a amino-terminál signální peptidy charakteristické pro vylučované proteiny byli schopni předpovědět, jaký zlomek proteomu je vylučován buňkou.[7] V roce 2001 stanovila stejná laboratoř standard sekretomiky - předpovědi založené pouze na aminokyselinové sekvenci nestačí k definici sekretomu. Oni použili dvourozměrná gelová elektroforéza a hmotnostní spektrometrie k identifikaci 82 proteinů vylučovaných B. subtilis, pouze 48 z nich bylo předpovězeno pomocí genom - metoda jejich předchozí práce.[8] To prokazuje potřebu ověření proteinů předpovězených nálezů.

Vzhledem k tomu, že byla odhalena komplikovaná povaha sekrečních cest - totiž že existuje mnoho neklasických cest sekrece a existuje mnoho nesekretovaných proteinů, které jsou součástí klasické sekreční cesty - je zapotřebí podrobnější definice sekretomu . V roce 2010 Agrawal a kol. navrhl definovat sekretom jako „globální skupinu vylučovaných proteinů do extracelulárního prostoru buňkou, tkání, orgánem nebo organismem v jakémkoli daném čase a za podmínek prostřednictvím známých a neznámých sekrečních mechanismů zahrnujících konstitutivní a regulované sekreční organely“.[9]

Výzvy sekretomické analýzy

Kontaminující látky

V kultuře jsou buňky obklopeny kontaminujícími látkami. Hovězí sérum z buněčných kultivačních médií a buněčných zbytků mohou kontaminovat sběr vylučovaných proteinů použitých pro analýzu. Bovinní kontaminanty představují zvláštní výzvu, protože proteinové sekvence mnoha bovinních extracelulárních proteinů jsou podobné fibronektin a fibulin-1, jsou podobné lidským proteinovým sekvencím.[1] K odstranění těchto znečišťujících látek lze buňky omyt PBS nebo bez séra střední (SFM) před inkubací v SFM a sběrem vylučovaných proteinů. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k prasknutí buněk a uvolnění intracelulárních proteinů.[1] Kromě toho musí být optimalizována inkubační doba a podmínky tak, aby metabolický stres, který lze vyvolat nedostatkem živin v SFM, neovlivnil sekretomickou analýzu.[10]

Nízká koncentrace

Některé proteiny jsou vylučovány v malém množství a poté dále zředěny v médiu pro buněčnou kulturu nebo v tělesné tekutině, což ztěžuje jejich detekci a analýzu. Lze použít metody koncentrace, jako je srážení TCA[10] stejně jako vysoce citlivé metody jako protilátkové mikročipy který dokáže detekovat i jednotlivé molekuly proteinu.[11]

Relevance in vitro studie

Provádí se mnoho sekretomických studií in vitro metodami buněčné kultury, ale není jasné, zda jsou vylučovány stejné proteiny in vivo. Stále více studií, zejména těch, které se zabývají sekretomem rakoviny, využívá in vivo metody k potvrzení relevantnosti získaných výsledků in vitro. Například mohou být shromažďovány proximální biologické tekutiny sousedící s nádorem za účelem provedení sekretomické analýzy.[1]

Metody

Předpověď pro celý genom

Mnoho secernovaných proteinů má N-koncovou peptidovou sekvenci, která signalizuje přesunutí přeloženého proteinu do endoplazmatické retikulum kde dochází ke zpracování, které nakonec povede k sekreci. Přítomnost těchto signálních peptidů může být použita k předpovědi sekretomu buňky.[1] Software, jako je SignalP[12] může identifikovat signální sekvence (a jejich místa štěpení), aby předpověděl vylučované proteiny. Od té doby transmembránové proteiny jsou také zpracovávány v ER, ale nejsou vylučovány, software jako server TMHMM se používá k předpovědi transmembránových domén, a proto k eliminaci falešných poplachů.[9] Některé sekreční proteiny nemají klasické signální peptidové sekvence. Tyto „sekreční proteiny bez vůdce“ (LSP) budou SignalP chybět. SecretomeP je software, který byl vyvinut s cílem předpovědět tyto neklasické sekreční proteiny z jejich sekvencí.[9] Celomanomové sekretomy byly předpovězeny pro širokou škálu organismů, včetně lidí, myší, zebrafish a stovek bakterií.[9]

Metody predikce celého genomu mají řadu problémů. Existuje vysoká možnost falešných pozitiv a falešných negativů. Kromě toho je genová exprese silně ovlivněna podmínkami prostředí, což znamená sekretom predikovaný z genomu nebo a cDNA Knihovna pravděpodobně nebude zcela odpovídat skutečnému tajemství.[9] Proteomické přístupy jsou nezbytné k ověření jakýchkoli předpokládaných vylučovaných proteinů.

Na základě kurace a výpočetní predikce je k dispozici několik databází nebo databází znalostí pro celý genom. Mezi tyto databáze patří databáze fungálních sekretomů (FSD), znalostní databáze fungálních sekretomů (FunSecKB),[13] a databázi bakteriálních sekretomů kyseliny mléčné.[14] Databáze subcelulárních poloh lidských a zvířecích bílkovin (MetaSecKB ) a databáze protist subcelulárního proteomu (ProtSecKB ) jsou také nedávno vydány. Ačkoli existují určité nepřesnosti ve výpočetní predikci, tyto databáze poskytují užitečné zdroje pro další charakterizaci proteinových subcelulárních umístění.

Proteomické přístupy

Analýza hmotnostní spektrometrie je nedílnou součástí sekretomiky. Sérum nebo supernatant obsahující vylučované proteiny se štěpí a proteáza a proteiny jsou odděleny 2D gelovou elektroforézou nebo chromatografické metody. Každý jednotlivý protein je poté analyzován hmotnostní spektrometrií a otisk peptidové hmoty generovaný může být spuštěn prostřednictvím databáze k identifikaci proteinu.[1]

Stabilní značení izotopů aminokyselinami v buněčné kultuře (SILAC) se ukázal jako důležitá metoda v sekretomice - pomáhá rozlišovat mezi vylučovanými proteiny a kontaminanty hovězího séra v buněčné kultuře. Supernatant z buněk pěstovaných v normálním médiu a buněk pěstovaných v médiu se stabilně izotopově značenými aminokyselinami se smíchá v poměru 1: 1 a analyzuje se hmotnostní spektrometrií. Bílkovinné kontaminanty v séru budou vykazovat pouze jeden vrchol, protože nemají značený ekvivalent.[1] Jako příklad byla úspěšně použita metoda SILAC k rozlišení mezi proteiny vylučovanými člověkem chondrocyty v kultuře a kontaminaci séra.[15]

Protilátka microarray je vysoce citlivá a vysoce výkonná metoda pro detekci proteinů, která se nedávno stala součástí sekretomické analýzy. Protilátky nebo jiný typ molekuly pojiva jsou fixovány na pevný podklad a je přidána fluorescenčně značená proteinová směs. Intenzity signálu se používají k identifikaci proteinů. Mikročipy protilátek jsou extrémně univerzální - lze je použít k analýze množství bílkovin ve směsi, různých proteinové izoformy, posttranslační úpravy a biochemická aktivita proteinů. Kromě toho jsou tyto mikročipy vysoce citlivé - mohou detekovat jednotlivé molekuly proteinu. Mikročipy protilátek se v současné době používají hlavně k analýze člověka plazma vzorky, ale lze je také použít pro kultivované buňky a sekretomiku tělních tekutin, což představuje jednoduchý způsob, jak vyhledat přítomnost mnoha proteinů najednou.[11]

Důsledky a význam

Objev biomarkerů rakoviny

Kromě toho, že jsou vylučované proteiny důležité v normálních fyziologických procesech, mají také nedílnou roli v tumorigeneze prostřednictvím buněčného růstu, migrace, invaze a angiogeneze, díky čemuž je sekretomika vynikající metodou pro objev biomarkerů rakoviny.[16] Použití tělní tekutiny nebo proteomické metody celého séra k identifikaci biomarkerů může být extrémně obtížné - tělesné tekutiny jsou komplexní a vysoce variabilní. Sekretomická analýza rakovinných buněčných linií nebo nemocné tkáně představuje jednodušší a konkrétnější alternativu pro objev biomarkerů.[10]

Dva hlavní biologické zdroje pro sekretomiku rakoviny jsou supernatanty rakovinných buněčných linií a proximální biologické tekutiny, tekutiny v kontaktu s nádor. Supernatant buněčné linie rakoviny je atraktivním zdrojem vylučovaných proteinů. Existuje mnoho standardizovaných buněčných linií a supernatant je mnohem jednodušší analyzovat než proximální tělesná tekutina. Není však jasné, zda je sekretom buněčné linie dobrým zastoupením skutečného nádoru v jeho specifickém mikroprostředí a že standardizovaná buněčná linie není příkladem heterogenity skutečného nádoru.[16] Analýza proximálních tekutin může poskytnout lepší představu o sekretomu lidského nádoru, ale tato metoda má také své nevýhody. Postupy pro odběr proximálních tekutin je stále třeba standardizovat a jsou zapotřebí nezhoubné kontroly. Analýzy mohou navíc komplikovat environmentální a genetické rozdíly mezi pacienty.[16]

Sekretomická analýza objevila potenciální nové biomarkery u mnoha typů rakoviny, včetně rakovina plic, rakovina jater, rakovina slinivky, kolorektální karcinom, rakovina prostaty, a rakovina prsu. Antigen specifický pro prostatu (PSA), současný standardní biomarker pro rakovinu prostaty, má nízkou diagnostickou specificitu - hladiny PSA nemohou vždy rozlišovat mezi agresivní a neagresivní rakovinou - a proto je velmi potřebný lepší biomarker. Pomocí sekretomické analýzy buněčných linií prostaty byla jedna studie schopna objevit více proteinů nalezených ve vyšších hladinách v séru pacientů s rakovinou než u zdravých kontrol.[10]

Existuje také velká potřeba biomarkerů pro detekci rakoviny prsu - v současné době existují biomarkery pouze pro monitorování pozdějších stadií rakoviny.[2] Sekretomická analýza buněčných linií rakoviny prsu vedla k objevu proteinu ALCAM jako nový biomarker se slibným diagnostickým potenciálem.[10]

Technologie asistované reprodukce

Analýza lidského embryonálního sekretomu by mohla být užitečná při hledání neinvazivní metody pro stanovení životaschopnosti embrya. v IVF, embrya jsou hodnocena podle morfologických kritérií ve snaze najít embrya s vysokou implantace potenciál. Nalezení kvantitativnější metody hodnocení by mohlo pomoci snížit počet embryí použitých v IVF, a tím snížit těhotenství vyššího řádu. Například jedna studie dokázala u mnoha vyvinout tajné otisky prstů blastocysty a našel 9 proteinů, které dokázaly rozlišit mezi blastocysty s normálním a abnormálním počtem chromozomy. Tento typ analýzy by mohl pomoci nahradit preimplantační genetický screening (PGS), která zahrnuje biopsii embryonálních buněk a může být škodlivá pro vývoj.[17]

Reference

  1. ^ A b C d E F G Hathout, Yetrib (2007). "Přístupy ke studiu buněčného sekretomu". Odborná recenze proteomiky. 4 (2): 239–48. doi:10.1586/14789450.4.2.239. PMID  17425459.
  2. ^ A b Pavlou, Maria P .; Diamandis, Eleftherios P. (2010). „Sekretomum rakovinné buňky: Dobrý zdroj pro objevování biomarkerů?“. Journal of Proteomics. 73 (10): 1896–906. doi:10.1016 / j.jprot.2010.04.003. PMID  20394844.
  3. ^ Grønborg, Mads; Kristiansen, Troels Zakarias; Iwahori, Akiko; Chang, Rubens; Reddy, Raghunath; Sato, Norihiro; Molina, Henrik; Jensen, Ole Nørregaard; Hruban, Ralph H. (leden 2006). „Objev biomarkerů ze sekretomu karcinomu pankreatu pomocí diferenčního proteomického přístupu“. Molekulární a buněčná proteomika. 5 (1): 157–171. doi:10,1074 / mcp.M500178-MCP200. ISSN  1535-9476. PMID  16215274.
  4. ^ Khan, Mohd M .; Ernst, Orna; Sun, Jing; Fraser, Iain D. C .; Ernst, Robert K .; Goodlett, David R .; Nita-Lazar, Aleksandra (2018-06-24). „Strukturální analýza založená na hmotnostní spektrometrii a strategie imunoproteomiky systémů pro dešifrování odpovědi hostitele na endotoxin“. Journal of Molecular Biology. 430 (17): 2641–2660. doi:10.1016 / j.jmb.2018.06.032. ISSN  1089-8638. PMID  29949751.
  5. ^ Khan, Mohd M .; Koppenol-Raab, Marijke; Kuriakose, Minna; Manes, Nathan P .; Goodlett, David R .; Nita-Lazar, Aleksandra (2018-03-20). „Dynamika hostitele-patogenu prostřednictvím cílené analýzy sekretomů stimulovaných makrofágů“. Journal of Proteomics. 189: 34–38. doi:10.1016 / j.jprot.2018.03.016. ISSN  1876-7737. PMC  6149218. PMID  29572161.
  6. ^ Hynes, R.O .; Naba, A. (21. září 2011). „Přehled matrisomu - soupis složek a funkcí mimobuněčné matice“. Perspektivy Cold Spring Harbor v biologii. 4 (1): a004903. doi:10.1101 / cshperspect.a004903. PMC  3249625. PMID  21937732.
  7. ^ Tjalsma, H .; Bolhuis, A .; Jongbloed, J. D. H .; Bron, S .; Van Dijl, J. M. (2000). „Transport proteinů závislých na peptidech u Bacillus subtilis: Průzkum sekretomu na základě genomu“. Recenze mikrobiologie a molekulární biologie. 64 (3): 515–47. doi:10.1128 / MMBR.64.3.515-547.2000. PMC  99003. PMID  10974125.
  8. ^ Antelmann, H .; Tjalsma, H; Voigt, B; Ohlmeier, S; Bron, S; Van Dijl, JM; Hecker, M (2001). „Proteomický pohled na předpovědi signálních peptidů na základě genomu“. Výzkum genomu. 11 (9): 1484–502. doi:10,1101 / gr. 182801. PMID  11544192.
  9. ^ A b C d E Agrawal, Ganesh Kumar; Jwa, Nam-Soo; Lebrun, Marc-Henri; Job, Dominique; Rakwal, Randeep (2010). "Rostlinný sekretom: Odemknutí tajemství vylučovaných proteinů". Proteomika. 10 (4): 799–827. doi:10.1002 / pmic.200900514. PMID  19953550.
  10. ^ A b C d E Makridakis, Manousos; Vlahou, Antonia (2010). "Proteomika sekretome pro objev biomarkerů rakoviny". Journal of Proteomics. 73 (12): 2291–305. doi:10.1016 / j.jprot.2010.07.001. PMID  20637910.
  11. ^ A b Mustafa, Shakhawan Abdulrahman; Hoheisel, Jörg D .; Alhamdani, Mohamed Saiel Saeed (2011). "Profilování sekretomů pomocí mikročipů protilátek". Molekulární biosystémy. 7 (6): 1795–801. doi:10.1039 / c1mb05071k. PMID  21505656.
  12. ^ Petersen, Thomas Nordahl; Brunak, Søren; von Heijne, Gunnar; Nielsen, Henrik (2011). "SignalP 4.0: rozlišování signálních peptidů z transmembránových oblastí". Přírodní metody. 8 (10): 785–786. doi:10.1038 / nmeth.1701. ISSN  1548-7091. PMID  21959131.
  13. ^ Lum, G .; Min, X. J. (2011). „FunSecKB: Houbová tajná databáze znalostí“. Databáze. 2011: bar001. doi:10.1093 / databáze / bar001. ISSN  1758-0463. PMC  3263735. PMID  21300622.
  14. ^ Zhou, Miaomiao; Theunissen, Daniel; Wels, Michiel; Siezen, Roland J (2010). „LAB-Secretome: komparativní analýza predikovaných extracelulárních a povrchově asociovaných proteinů bakterií kyseliny mléčné v měřítku genomu“. BMC Genomics. 11 (1): 651. doi:10.1186/1471-2164-11-651. ISSN  1471-2164. PMC  3017865. PMID  21092245.
  15. ^ Poláček, Martin; Bruun, Jack-Ansgar; Johansen, Oddmund; Martinez, Inigo (2010). "Rozdíly v sekretomu chrupavkových explantátů a kultivovaných chondrocytů odhalených technologií SILAC". Journal of Orthopedic Research. 28 (8): 1040–9. doi:10.1002 / jor.21067. PMID  20108312.
  16. ^ A b C Karagiannis, George S .; Pavlou, Maria P .; Diamandis, Eleftherios P. (2010). „Sekretomika rakoviny odhaluje patofyziologické cesty v molekulární onkologii rakoviny“. Molekulární onkologie. 4 (6): 496–510. doi:10.1016 / j.molonc.2010.09.001. PMC  5527923. PMID  20934395.
  17. ^ Katz-Jaffe, M.G .; McReynolds, S .; Gardner, D. K.; Schoolcraft, W.B. (2009). „Úloha proteomiky při definování lidského embryonálního sekretomu“. Molekulární lidská reprodukce. 15 (5): 271–7. doi:10,1093 / mol / mezera012. PMC  2666223. PMID  19223337.