STARR-seq - STARR-seq

STARR-seq (zkratka pro samočinné přepisování aktivního regulačního regionu) je metoda stanovení zesilovač aktivita pro miliony kandidátů z libovolných zdrojů DNA. Používá se k identifikaci sekvencí, které fungují jako transkripční enhancery přímým, kvantitativním způsobem a v celém genomu.[1]

A
Metodika STARR-seq

Úvod

v eukaryoty, transkripce je regulován sekvenčně specifickými proteiny vázajícími DNA (transkripční faktory ) spojené s genem promotér a také sekvencemi vzdálené kontroly včetně zesilovačů. Zesilovače jsou nekódující sekvence DNA, které obsahují několik vazebných míst pro různé transkripční faktory.[2] Obvykle získávají transkripční faktory, které modulují chromatin struktury a přímo interagují s transkripčním aparátem umístěným na promotoru gen. Zesilovače jsou schopny regulovat transkripci cílových genů způsobem specifickým pro daný buněčný typ,[1] nezávisle na jejich poloze nebo vzdálenosti od promotoru genů. Občas mohou regulovat transkripci genů umístěných v jiném chromozóm.[3] Znalosti o enhancerech se však doposud omezovaly na studium malého počtu enhancerů, protože bylo obtížné je přesně identifikovat v celém genomu.[2] Mnoho regulačních prvků navíc funguje pouze v určitých typech buněk a konkrétních podmínkách.[4]

Detekce zesilovače

Detekce vylepšení v Drosophila je originální metodika používající náhodné vložení vektoru odvozeného od transposonu, který kóduje reportérový protein za minimálním promotorem. Tento přístup umožňuje pozorovat expresi reportéru v transgenní zvířata a poskytuje informace o blízkých genech, které jsou regulovány těmito sekvencemi. Objev a charakterizace buněčných typů spolu s geny podílejícími se na jejich stanovení byly objevem této techniky významně zlepšeny.[5][6][7][8]

Během posledních několika let postgenomické technologie vykazovaly specifické rysy připravených a aktivních enhancerů, které zlepšily objev enhancerů.[2] Vývoj nových metod, jako je hluboké sekvenování hypersenzitivních míst DNasy I (DNase-Seq ), izolace regulačních prvků za pomoci formaldehydu ((FAIRE-Seq ) a imunoprecipitace chromatinu následovaná hlubokým sekvenováním (Sekvenování čipů ) poskytují předpovědi zesilovače v celém genomu pomocí funkcí chromatinu souvisejících se zesilovačem.[1]

aplikace

Sekvenování DHS a FAIRE neposkytují přímé funkční nebo kvantitativní odečítání aktivity zesilovače. K získání tohoto je zapotřebí reportérových testů, které odvozují sílu zesilovače od množství reportérských přepisů. Navíc takové testy nejsou schopny nabídnout miliony testů požadovaných pro identifikaci zesilovačů v celém genomu.[1]Vývoj STARR-seq pomáhá identifikovat enhancery přímo, kvantitativně a v celém genomu. S využitím znalostí, že zesilovače mohou pracovat nezávisle na jejich relativních umístěních, jsou kandidátské sekvence umístěny za minimálním promotorem, což umožňuje aktivním zesilovačům přepisovat se samy. Síla každého zesilovače se pak odráží v jeho bohatosti mezi buněčnými RNA. Taková přímá vazba kandidátních sekvencí na aktivitu zesilovače umožňuje paralelní hodnocení milionů fragmentů DNA z libovolných zdrojů.[1]

Metodologie

Genomická DNA je náhodně stříhána a štěpena na malé fragmenty. Adaptéry jsou ligovány na fragmenty DNA vybrané podle velikosti. Dále jsou fragmenty spojené s adaptérem zesíleny a PCR produkty jsou purifikovány a následně umístěny kandidátské sekvence po směru od minimálního promotoru screeningových vektorů, což jim dává příležitost samy se přepsat. Kandidátní buňky se poté transfekují reportérovou knihovnou a kultivují. Poté celkem RNA jsou extrahovány a poly-A Izolované RNA. Použitím reverzní transkripce metoda, cDNA jsou produkovány, amplifikovány a poté jsou kandidátní fragmenty použity pro vysokou propustnost spárované koncové sekvenování. Čtení sekvence je mapováno na referenční genom a probíhá výpočetní zpracování dat.[1]

Objev zesilovače v Drosophile

Uplatnění této technologie na genom Drosophila, Arnold et al.[1] nalezeno 96% neopakujícího se genomu s alespoň 10násobným pokrytím. Autoři zjistili, že většina identifikovaných enhancerů (55,6%) byla umístěna uvnitř introny, zejména v prvním intronu a intergenové oblasti. 4,5% zesilovačů bylo umístěno na stránky zahájení transkripce (TSS), což naznačuje, že tyto enhancery mohou spustit transkripci a také zlepšit transkripci ze vzdáleného TSS.[1] Nejsilnější zesilovače byly blízko geny pro úklid jako jsou enzymy nebo složka cytoskelet a vývojové regulátory, jako jsou transkripční faktory. Nejsilnější zesilovač byl umístěn v intronu transkripčního faktoru zfh1. Tento transkripční faktor reguluje neuropeptid exprese a růst larválních neuromuskulárních spojení v Drosophila.[9] The ribozomální protein geny byly jedinou třídou genů se špatným hodnocením enhancerů. Autoři navíc prokázali, že mnoho genů je regulováno několika nezávislými aktivními zesilovači dokonce i v jediném typu buňky. Kromě toho hladiny genové exprese v průměru korelovaly se součtem sil zesilovače na gen, což podporovalo přímé spojení mezi genovou expresí a aktivitou zesilovače.[1]

Charakterizace regulačních variantních alel v kohortách lidské genetické studie

Použitím této technologie na charakterizaci a objev regulačních variantních alel, Vockley et al.[10] charakterizoval účinky lidské genetické variace na funkci nekódujících regulačních prvků měřením aktivity 100 domnělých enhancerů zachycených přímo z genomů 95 členů studijní kohorty. Tento přístup umožňuje funkční jemné mapování kauzálních regulačních variant v oblastech vysoké vazebné nerovnováhy identifikovaných pomocí eQTL analýzy. Tento přístup poskytuje obecnou cestu vpřed k identifikaci poruch v regulačních prvcích genů, které přispívají ke komplexním fenotypům.

Kvantifikace aktivity zesilovače fragmentů DNA obohacených ChIP

STARR-seq byl použit k měření regulační aktivity fragmentů DNA, které byly obohaceny o místa obsazená specifickými transkripčními faktory. Klonování Čip Knihovny DNA generované imunoprecipitací chromatinu z glukokortikoidový receptor do STARR-seq umožnilo kvantifikaci aktivity zesilovače indukované glukokortikoidy v měřítku genomu.[11] Tento přístup je užitečný pro měření rozdílů v aktivitě zesilovače mezi místy, která jsou vázána stejným transkripčním faktorem.

Výhody

  • Kvantitativní rozbor detekce zesilovače v celém genomu.[1]
  • Použitelná technika pro screening libovolných zdrojů DNA v jakémkoli typu buňky nebo tkáni, která umožňuje adekvátní zavedení reportérových konstruktů.[1]
  • Metoda s vysokou mírou detekce (> 99%) využívající sekvenování párů, dokonce i pro sekvence, které obsahují prvky destabilizující přepis.
  • Technika kvantitativního vyhodnocení síly enhancerů a identifikace endogenně umlčených enhancerů jejich integrací do chromozomálního kontextu.[1]

Budoucí pokyny

STARR-seq kombinací tradičního přístupu s vysoce výkonnou sekvenční technologií a vysoce specializovanými bio-výpočetními metodami je schopen detekovat zesilovače kvantitativně a v celém genomu. Studium genové regulace a jejich odpovědných drah v genomu během normálního vývoje a také u onemocnění může být velmi náročné. Proto aplikace STARR-seq na mnoho buněčných typů napříč organismy podporuje identifikaci buněčných typů specifických genových regulačních prvků a prakticky hodnotí nekódování mutace způsobující nemoc. Nedávno bylo vyvinuto a v rozsáhlé míře ověřeno v savčích buněčných liniích související přístup spojující zachycení oblastí zájmu o techniku ​​STARR-seq.[12]

Reference

  1. ^ A b C d E F G h i j k l Arnold, Cosmas; Daniel Gerlach; Christoph Stelzer; Łukasz M. Boryń; Martina Rath; Alexander Stark (leden 2013). „Mapy aktivity kvantitativního zesilovače pro celý genom identifikované STARR-seq“. Věda. 339 (6123): 1074–7. doi:10.1126 / science.1232542. PMID  23328393.
  2. ^ A b C Xu, Jian; Stephen T. Smale (listopad 2012). „Designing the Enhancer Landscape“. Buňka. 151 (5): 929–931. doi:10.1016 / j.cell.2012.11.007. PMC  3732118. PMID  23178114.
  3. ^ Ong, Chin-Tong; Victor G. Corces (duben 2011). „Funkce Enhancer: nové poznatky o regulaci tkáňové specifické genové exprese“. Genetika hodnocení přírody. 12 (4): 283–293. doi:10.1038 / nrg2957. PMC  3175006. PMID  21358745.
  4. ^ Baker, Monya (28. dubna 2011). "Zvýrazňovače zvýraznění". Přírodní metody. 8 (5): 373. doi:10.1038 / nmeth0511-373. PMID  21678620.
  5. ^ Bellen, Hugo J (prosinec 1999). „Deset let detekce vylepšení: Poučení z běhu“. Rostlinná buňka. 11 (12): 2271–2281. doi:10.2307/3870954. JSTOR  3870954. PMC  144146. PMID  10590157.
  6. ^ Bier, E; Vaessin H; Ovčáci; Lee K; McCall K; Barbel S; Ackerman L; Carretto R; Uemura T; Grell E (září 1989). „Hledání vzoru a mutace v genomu Drosophila pomocí vektoru P-lacZ“. Geny a vývoj. 3 (9): 1273–1287. doi:10,1101 / gad. 3. 9. 1273. PMID  2558049.
  7. ^ Wilson, C; Pearson RK; Bellen HJ; O’Kane CJ; Grossniklaus U; Gehring WJ (září 1989). „Detekce zesilovače zprostředkovaného P-elementem: účinná metoda pro izolaci a charakterizaci vývojově regulovaných genů v Drosophile“. Geny a vývoj. 3 (9): 1301–1313. doi:10,1101 / gad. 3.9.1301. PMID  2558051.
  8. ^ O'Kane, CJ; Gehring WJ (prosinec 1987). „Detekce in situ genomových regulačních prvků v Drosophile“. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24): 9123–9127. doi:10.1073 / pnas.84.24.9123. PMC  299704. PMID  2827169.
  9. ^ Volger, G; Urban J (červenec 2008). „Transkripční faktor Zfh1 se podílí na regulaci neuropeptidové exprese a růstu larválních neuromuskulárních spojení v Drosophila melanogaster.“ Vývojová biologie. 319 (1): 78–85. doi:10.1016 / j.ydbio.2008.04.008. PMID  18499094.
  10. ^ Vockley, Christopher M .; Guo, Cong; Majoros, William H .; Nodzenski, Michael; Scholtens, Denise M .; Hayes, M. Geoffrey; Lowe, William L .; Reddy, Timothy E. (01.08.2015). „Masivně paralelní kvantifikace regulačních účinků nekódujících genetických variací v lidské kohortě“. Výzkum genomu. 25 (8): 1206–1214. doi:10,1101 / gr. 190090,115. ISSN  1549-5469. PMC  4510004. PMID  26084464.
  11. ^ Vockley, Christopher M .; D’Ippolito, Anthony M .; McDowell, Ian C .; Majoros, William H .; Safi, Alexias; Song, Lingyun; Crawford, Gregory E .; Reddy, Timothy E. (2015-08-25). „Direct GR Binding Sites Potentiate Clusters of TF Binding across the Human Genome“. Buňka. 166 (5): 1269–1281. doi:10.1016 / j.cell.2016.07.049. ISSN  0092-8674. PMC  5046229. PMID  27565349.
  12. ^ Vanhille L., A. Griffon, M.A. Maqbool, J. Zacarias, L.T.M. Dao, N. Fernandez, B. Ballester, J. C. Andrau, S. Spicuglia (2015). CapStarr-seq: vysoce výkonná metoda pro kvantitativní hodnocení aktivity zesilovače u savců. Nat. Commun. 6: 6905.