FAIRE-Seq - FAIRE-Seq

FAIRE-Seq (FormaldehydApomáhal Jásolace of Rrovnostářský Elements) je metoda v molekulární biologie používá se ke stanovení sekvencí oblastí DNA v genom spojené s regulační činností.^[1] Tato technika byla vyvinuta v laboratoři Jasona D. Liebe na University of North Carolina, Chapel Hill. Na rozdíl od DNase-Seq protokol FAIRE-Seq nevyžaduje permeabilizaci buněk nebo izolaci jader a může analyzovat jakýkoli typ buněk. Ve studii sedmi různých typů lidských buněk DNase-seq a FAIRE-seq vyvolaly silnou křížovou validaci, přičemž každý buněčný typ měl 1 až 2% lidského genomu jako otevřený chromatin.

Pracovní postup

Protokol je založen na skutečnosti, že formaldehyd síťování je efektivnější v nukleosom -vázaný DNA než je tomu v oblastech genomu s deplecí nukleosomů. Tato metoda poté odděluje nezesítěnou DNA, která se obvykle nachází v otevřeném chromatinu, který je následně sekvenován. Protokol sestává ze síťování, extrakce fenolem a sekvenování DNA ve vodné fázi.

FAIRE

FAIRE využívá biochemické vlastnosti DNA vázané na bílkoviny k oddělení oblastí zbavených nukleosomů v genomu. Buňky budou podrobeny zesíťování, čímž se zajistí, že interakce mezi nukleosomy a DNA budou fixní. Po použití ultrazvuku se fragmentovaná a fixovaná DNA oddělí pomocí extrakce fenol-chloroformem. Tato metoda vytváří dvě fáze, organickou a vodnou. Díky svým biochemickým vlastnostem budou fragmenty DNA zesítěné s nukleosomy přednostně sedět v organické fázi. Nukleosomem ochuzené nebo „otevřené“ oblasti se naopak nacházejí ve vodné fázi. Specifickou extrakcí vodné fáze budou vyčištěny a obohaceny pouze oblasti zbavené nukleosomů.^[1]

Sekvenování

Fragmenty DNA extrahované FAIRE lze analyzovat vysoce výkonným způsobem za použití sekvenování nové generace techniky. Obecně se knihovny vytvářejí ligací specifických adaptérů k fragmentům DNA, které jim umožňují shlukovat se na platformě a být amplifikovány, což vede ke čtení / stanovení sekvencí DNA, a to paralelně k milionům fragmentů DNA.

V závislosti na velikosti genomu, na kterém se FAIRE-seq provádí, je vyžadováno minimum čtení, aby se vytvořilo vhodné pokrytí dat, což zajistí, že lze určit správný signál.^[2][3] Kromě toho je referenční nebo vstupní genom, který nebyl zesítěný, často sekvenován vedle, aby se určila úroveň šumu pozadí.

Všimněte si, že extrahované fragmenty FAIRE lze kvantifikovat alternativní metodou pomocí kvantitativní PCR. Tato metoda však neumožňuje kvantifikaci extrahovaných fragmentů v širokém / vysokém výkonu genomu.

Citlivost

Existuje několik aspektů FAIRE-seq, které vyžadují pozornost při analýze a interpretaci dat. Za prvé bylo uvedeno, že FAIRE-seq bude mít vyšší pokrytí v oblastech zesilovače než v oblastech promotoru.^[4] To je v kontrastu s alternativní metodou DNase-seq, o které je známo, že vykazuje vyšší citlivost vůči promotorovým oblastem. Kromě toho bylo uvedeno, že FAIRE-seq vykazuje preference pro vnitřní introny a exony.^[5] Obecně se také věří, že data FAIRE-seq zobrazují vyšší úroveň pozadí, což z nich činí méně citlivou metodu.^[6]

Výpočetní analýza

V prvním kroku jsou data FAIRE-seq mapována na referenční genom použitého modelového organismu.

Dále se identifikace genomových oblastí s otevřeným chromatinem provádí pomocí algoritmu volání píku. Balíčky k tomu nabízejí různé nástroje (např. ChIPOTle^[7] ZINBA^[8] a MACS2^[9]). ChIPOTle používá k identifikaci statisticky významných signálů posuvné okno 300 bp. Naproti tomu MACS2 identifikuje obohacený signál kombinací parametru callpeak s dalšími možnostmi jako 'široký', 'široký mezní', 'žádný model' nebo 'posun'. ZINBA je obecný algoritmus pro detekci obohacení v souboru krátkých dat.^[10] Pomáhá tak při přesné detekci signálu ve složitých datových sadách s nízkým poměrem signálu k šumu.

PostelNástroje^[11] se používá ke sloučení obohacených oblastí, které se nacházejí blízko sebe, za vzniku CORE (shluk otevřených regulačních prvků). To pomáhá při identifikaci oblastí přístupných chromatinu a regulačních vzorů genů, které by byly jinak nezjistitelné, s ohledem na nižší rozlišení, které FAIRE-seq často přináší.

Data se obvykle vizualizují jako stopy (např. BigWig) a lze je nahrát do prohlížeče genomu UCSC.^[12]

Hlavní omezení této metody, tj. Nízký poměr signálu k šumu ve srovnání s jinými testy dostupnosti chromatinu, činí výpočetní interpretaci těchto dat velmi obtížnou.^[13]

Alternativní metody

Existuje několik metod, které lze použít jako alternativu k FAIRE-seq. DNase-seq využívá schopnost enzymu DNázy I štěpit volnou / otevřenou / přístupnou DNA k identifikaci a sekvenování otevřeného chromatinu.^[14][15] Následně vyvinutý ATAC-seq zaměstnává Tn5 transpozázu, která inzeruje specifikované fragmenty nebo transpozony do přístupných oblastí genomu k identifikaci a sekvenování otevřeného chromatinu.^[16]

Reference