Promotor PBAD - PBAD promoter

Obrázek 1. Vyjádření Arab, araA a araC v přítomnosti arabinózy. V přítomnosti arabinózy se arabinóza váže na arabinosová vazebná místa AraC, což způsobuje, že AraC dimerizuje na I1 a já2 operátory. To umožňuje přístup CAP k vazbě na vazebná místa CAP, což zase pomáhá rekrutovat RNA polymerázu do obou P.ŠPATNÝ a PC promotory a aktivuje transkripci.

PŠPATNÝ (systematicky araBp) je promotér nalezen v bakterie a zejména jako součást plazmidy používané v laboratorních studiích. Pořadatel je součástí arabinóza operon jehož název je odvozen od geny to reguluje transkripce z: Arab, araA, a araD.[1][2] v E-coli, P.ŠPATNÝ promotor sousedí s PC promotér (systematicky araCp), který přepisuje araC gen v opačném směru. araC kóduje AraC protein, který reguluje aktivitu jak PŠPATNÝ a PC promotéři.[3][4][5] The cyklický AMP receptorový protein VÍČKO váže se mezi PŠPATNÝ a PC promotory stimulující transkripci obou, když jsou vázány cAMP.[6]

Nařízení z P.ŠPATNÝ

Zahájení transkripce na PŠPATNÝ promotor se vyskytuje v přítomnosti vysoké arabinózy a nízké glukóza koncentrace.[7] Po navázání arabinózy na AraC se N-terminál rameno AraC je uvolněno z jeho DNA vazebná doména prostřednictvím mechanismu „spínače světla“.[1][2] To umožňuje AraC dimerizovat a svázat I.1 a já2 operátory.[3] Dimer AraC-arabinózy na tomto místě přispívá k aktivace P.ŠPATNÝ promotér.[2] Navíc se CAP váže na dvě vazebná místa CAP proti proudu I.1 a já2 operátory a pomáhá aktivovat PŠPATNÝ promotér.[6] V přítomnosti jak vysoké arabinózy, tak vysokých koncentrací glukózy však nízké hladiny cAMP zabraňují CAP v aktivaci PŠPATNÝ promotér.[7] Předpokládá se, že PŠPATNÝ aktivace promotoru pomocí CAP a AraC je zprostředkována prostřednictvím kontaktů mezi C-terminál doména α-podjednotky RNA polymeráza a proteiny CAP a AraC.[8]

Obrázek 2. Vyjádření Arab, araA a araC nedochází, pokud není přítomna arabinóza. Při absenci arabinózy AraC dimerizuje, zatímco je vázán na O2 a já1 stránky operátorů, smyčkování DNA. Smyčka zabraňuje vazbě CAP a RNA polymerázy, které normálně aktivují transkripci obou PŠPATNÝ a PC.

Bez arabinózy a bez ohledu na koncentraci glukózy je PŠPATNÝ a PC promotéři jsou potlačen od AraC.[2][7] N-koncové rameno AraC interaguje s jeho vazebnou doménou DNA, což umožňuje dvěma proteinům AraC vázat se na O2 a já1 stránky operátorů.[1] O2 provozovatel se nachází v rámci araC gen. Dimer AraC se také váže na O1 operátor a potlačuje PC promotér prostřednictvím a negativní autoregulační zpětná vazba smyčka.[2] Dva vázané proteiny AraC dimerizují a způsobují smyčky DNA.[3][4] Smyčka zabraňuje vazbě CAP a RNA polymerázy, které normálně aktivují transkripci obou PŠPATNÝ a PC.

Přepis P.ŠPATNÝ

Vysoká arabinóza

Nízká arabinóza

Vysoká glukóza

Potlačený

Potlačený

Nízká hladina glukózy

Aktivní

Potlačený

Vzdálenost mezi O2 a já1 stránky operátorů jsou kritické. Přidání nebo odebrání 5 základní páry mezi O2 a já1 stránky operátorů ruší represi zprostředkovanou AraCŠPATNÝ promotér.[1] Požadavek na rozteč vyplývá z dvojitá spirála povaha DNA, ve kterém je úplné otočení šroubovice přibližně 10,5 nukleotidy. Proto přidání nebo odebrání 5 párů bází mezi O2 a já1 stránky operátora otáčí šroubovici zhruba o 180 stupňů. Tím se obrátí směr, kterým je O2 operátor čelí, když je DNA ve smyčce, a brání dimerizaci O2 svázané AraC se svázaným I.1 araC.[1][2]

The P.ŠPATNÝ promotor na expresních plazmidech

Obrázek 3. Reprezentace promotoru PBAD 33 na plazmidu s běžnými cis působícími oblastmi. Zkratky jsou definovány jako původ fagemidů (původ f1), rezistence na chloramfenikol (CmR), původ plazmidu (p15A ori), gen araC (araC), operátorská místa araC (araC O2 a O1), vazebné místo CAP (CAP BS), indukční místa araC (I1 / I2), promotor PBAD (pBAD) a vícenásobné klonovací místo (MCS).


The P.ŠPATNÝ promotor umožňuje přísnou regulaci a kontrolu cílového genu in vivo.[7] Jak bylo vysvětleno výše, PŠPATNÝ je regulováno přidáním a nepřítomností arabinóza. Jak bylo testováno, promotor může být dále potlačován se sníženými hladinami tábor přidáním glukózy.[7] Plazmidové vektory byly konstruovány a testovány pomocí a volitelná značka (CmR v tomto případě), původ replikace, araC a operony, více klonovacích stránek a PŠPATNÝ promotér. Studie ukazují, že vektory jsou vysoce exprimovány a mohou být použity v kombinaci s chromozomálními nulové alely, ke studiu ztráty funkce esenciálních genů.[7]

Reference

  1. ^ A b C d E Protein Schleif R. AraC, regulace L-arabinózového operonu v Escherichia coli a mechanismus přepínání světla účinku AraC. FEMS Microbiol Rev (2010) 1–18.
  2. ^ A b C d E F Protein Schleif R. AraC: vztah lásky a nenávisti. Bioessays 2003, 25: 274-282.
  3. ^ A b C Reed WL, Schleif RF. Hemiplegické mutace v proteinu AraC. J. Mol. Biol. (1999) 294, 417-425.
  4. ^ A b Lobell RB, Schleif RF. DNA smyčky a uvolnění pomocí AraC proteinu. Věda. 26. října 1990; 250 (4980): 528-32.
  5. ^ Soisson SM, MacDougall-Shackleton B, Schleif R, Wolberger C. Strukturální základ pro ligomerem regulovanou oligomerizaci AraC. Věda. 1997 18. dubna; 276 (5311): 421-5.
  6. ^ A b Dunn T.M., Schleif R. Analýza delece promotorů Escherichia coli ara PC a PBAD. J.Mol. Biol. (1984) 180, 201-204.
  7. ^ A b C d E F Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J. Těsná regulace, modulace a vysoká úroveň exprese vektory obsahujícími promotor arabinózy PBAD. J Bacteriol. Července 1995; 177 (14): 4121–4130.
  8. ^ Johnson CM, Schleif RF. Spolupráce proteinu aktivátoru katabolitů a AraC In Vitro u promotora araFGH. J Bacteriol. Dubna 2000; 182 (7).